Entwicklung einer Synthesestrategie aminoacylierter Dimerfragmente der tRNA mittels Festphasensynthese

Für die Synthese misacylierter tRNA’s existiert ein Verfahren, welches von einer 3‘-seitig um zwei Nukleotide verkürzten tRNA ausgeht, die mittels T4 RNA Ligase mit einem zuvor über chemische Methoden aminoacylierten Dimerfragment (pdCpA-naa, naa: nicht natürliche Aminosäure) zu einer kompletten, misacylierten tRNA ligiert wird. Im Rahmen dieser Promotion sollte ein Verfahren entwickelt werden, das einen Zugang zu aminoacylierten 3‘-Dimerfragmenten der tRNA mittels einer Festphasensynthese ermöglicht. Das hierfür entwickelte Konzept sah eine geeignet funktionalisierte Festphase vor, die die Synthese des Dimers in 5‘-3‘ Richtung erlauben sollte. Die erforderliche 5‘-Phosphorylierung sollte in der Synthese bereits beinhaltet sein. Bei der sich anschließenden Entschützung des Dimers war der Verbleib desselben an der Festphase vorgesehen. Dieses sollte in entschützter Form mit einer N-geschützten, nicht natürlichen Aminosäure am 3‘-Ende verestert werden. Das erhaltene, aminoacylierte Dimer sollte in einem letzten Schritt mit Hinblick auf die hydrolyseempfindliche Aminoacylbindung unter möglichst schonenden Bedingungen von der Festphase abgespalten werden. <br>Das als Festphase gewählte Tentagel NOH wurde mit Bis-(2-Hydroxyethyl)disulfid als Linker funktionalisiert, welcher durch Sulfidbehandlung reduktiv spaltbar ist. Für die Dimersynthese wurden N-aryloylgeschützte 5‘-Phosphoramidite des Adenosins und Desoxycytidins synthetisiert. Nach der Dimersynthese wurde dieses orthogonal zur Abspaltung mit konzentriertem Ammoniak entschützt. Aufgrund einer partiellen Abspaltung des Dimers während des Entschützungsschrittes waren mildere Abspaltungsbedingungen erforderlich. Hierfür wurden N-acetylgeschützte Phosphoramidite synthetisiert, und das resultierende, acetylgeschützte Dimer konnte unter Ausbleiben einer partiellen Abspaltung mit Methylamin entschützt werden. <br>Für die Evaluation der Abspaltung wurde das festphasengebundene, entschützte Dimer bezüglich seiner Abspaltungskinetik unter verschiedenen Bedingungen untersucht. In manchen Fällen war die Überführung eines beobachteten Zwischenprodukts in das Dimer der zeitbestimmende Faktor. HPLC-MS Studien stehen in Übereinstimmung mit der Hypothese, daß es sich bei dem Zwischenprodukt um das Dimer handelt, dessen Linkeranteil noch nicht eliminiert wurde. Für eine Abschätzung der Stabilität der Aminoacylbindung wurde ein an der Aminosäure N-geschütztes, aminoacyliertes Dimer in Lösung synthetisiert und unter den verschiedenen Abspaltungsbedingungen getestet. Die unter verschiedenen Abspaltungsbedingungen erhaltenen Mengen an Hydrolyseprodukt lagen jeweils bei ca. 60 %, wenn die zuvor ermittelten, minimalen Abspaltungszeiten eingehalten wurden. Ein am Adenosin 2‘-O-methyliertes, aminoacyliertes Dimer wurde analog synthetisiert. Dieses Aminoacyldinukleotid zeigte mit ca. 10 % Hydrolyseprodukt eine wesentlich höhere Stabilität der Aminoacylbindung. <br>Die Aminoacylierung des festphasengebundenen Dimers wurde zuerst an dem nicht methylierten Dimer vorgenommen. Diese wurde in Analogie der Veresterung in Lösung vorgenommen. Die entsprechend den Stabilitäts- und Abspaltungsstudien gewählten Abspaltungsbedingungen lieferten ein größenordnungsmäßig zu erwartendes Gemisch an aminoacyliertem und hydrolisiertem Dimer. Eine Übertragung der Ergebnisse auf das 2‘-O-methylierte Dimer waren hinsichtlich Synthese und Entschützung an fester Phase erfolgreich, die Aminoacylierung ließ sich in den bisherigen Versuchen nicht auf das festphasengebundene, methylierte Dimer übertragen. <br>Unter der Voraussetzung, daß die Aminoacylierung an fester Phase mit 2‘-O-geschützten Dimeren machbar ist, würde durch die Verwendung von photolabilen Schutzgruppen an der 2‘-Position des Adenosins und Aminofunktion der Aminosäure eine Festphasensynthese aminoacylierten 3‘-Dimerfragmenten der tRNA möglich.

Author dc:creator

• Wistuba, Thorsten

Contributors dc:contributor

• Bannwarth, Willi

• Phosphoramidite
• pdCpA
• suppressor-t-RNA
• solid phase synthesis
• aminoacylation
• phosphoramidites

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