Röntgenstrukturanalyse der Urocanase aus Pseudomonas Putida

In dieser Arbeit wurde die Urocanat Hydratase (Urocanase) aus Pseudomonas putida, das zweite Enzym des Histidinabbauweges, gereinigt und kristallisiert. Die Struktur der Urocanase wurde mit röntgenkristallographischen Methoden gelöst und verfeinert. Zusätzlich wurden inaktive Homologe der Urocanase hergestellt, bei denen neben dem Kofaktor NAD+ auch das Substrat Urocanat (Imidazolacrylat) im aktiven Zentrum identifiziert wurde. Darauf aufbauend wurde ein Reaktionsmechanismus vorgeschlagen. <br>Kristalle der Urocanase aus P. putida wurden erstmals von Lenz (1993) und später von Schwede (1999) erhalten. Diese Kristalle waren jedoch kaum reproduzierbar und nicht von ausreichender Qualität für eine röntgenographische Strukturlösung. Deshalb wurde im Rahmen dieser Arbeit ein neues Reinigungsprotokoll etabliert. Darüber hinaus konnte das schlechte Kristallisationsverhalten auf unspezifische Aggregationen zurückgeführt werden, wie es mit einer Gelpermeations Chromatographie gezeigt wurde. Die Aggregationen waren unter reduktiven Bedingungen vollständig reversibel, so dass ein oberflächenexponiertes Cystein als Ursache vermutet wurde. Das stimmt mit der Berechnung der Oberflächenwahrscheinlichkeiten aller Cysteine überein. Nach Mutation des Cys198 zu einem Serin (Urocanase-S) waren keine unspezifischen Aggregationen mehr zu beobachten. Es resultierten röntgentaugliche Kristalle der Raumgruppe C2, die nach Verfeinerung der Bedingungen eine Auflösung bis 1.76 A erreichten. <br>Zur Strukturlösung wurde die MAD-Methode angewendet. Dabei wurde Urocanase in einem Methionin-auxotrophen Bakterienstamm exprimiert und dem Medium L-Selenomethionin zugesetzt, wodurch Se als Schweratom eingebaut wurde. Die anomale Streuung von 28 gefundenen Selen-Atomen pro asymmetrischer Einheit wurde schließlich zur Lösung des Phasenproblems verwendet. <br>Die Struktur zeigt, dass die Urocanase ein symmetrisches Homodimer aus 2*557 Aminosäureresten ist. Jede Untereinheit besteht aus zwei Domänen, wobei ein N(1-141)- und ein C(344-557)-terminaler Teil die Kerndomäne und die Reste 142-343 die NAD-Domäne bilden. Die Kerndomäne besteht aus einem großen 8-strängigen und einem kleinen 3-strängigen beta Faltblatt und enthält zehn alpha Helices. Sie ist mit einer Fläche von 3235 Å2 für den festen Dimerkontakt verantwortlich. Die NAD-Domäne besteht aus einem 7-strängigen parallelen beta Faltblatt und acht umrahmenden alpha-Helices. Das aktive Zentrum liegt zwischen den Domänen. <br>Zur genauen Analyse des katalytischen Mechanismus, wurde die Aktivitätsmutante R455A (Urocanase-SA) hergestellt, da diese Aminosäure aufgrund ihrer räumlichen Nähe zum NAD+ als für die Katalyse essentiell erachtet wurde. Die hergestellte Mutante war tatsächlich inaktiv, so dass Kokristalle mit Substrat erzeugt und untersucht werden konnten. Ebenso wurden Kristalle mit Substrat und dem Inhibitor Imidazolylpropionat getränkt und röntgenographisch untersucht. Durch das Erreichen einer sehr hohen Auflösung von 1.14 Å, konnte das Modell anisotrop verfeinert werden. Das Substrat konnte im aktiven Zentrum lokalisiert werden, wobei im Nachhinein nicht genau gesagt werden kann, ob die Kokristallisationsexperimente erfolgreich waren, oder ob das Substrat bereits während der Proteinexpression aufgenommen wurde. Die Inhibitor-Tränk-Experimente der Urocanase-SA zeigten keine zusätzliche Dichte im aktiven Zentrum. <br>Anhand der beobachteten Geometrie im aktiven Zentrum wurde der Mechanismus im Detail diskutiert und publizierte Vorschläge auf ihre Richtigkeit hin überprüft. So konnte gezeigt werden, dass Cys411 mit seiner angeblich katalytischen Funktion mit einem Abstand von ca. 10 Å zum aktiven Zentrum bei der Katalyse keine Rolle spielen kann.

Author dc:creator

• Keßler, Dirk

Contributors dc:contributor

• Schulz, Georg E.

• Urocanase
• Röntgenstruktur
• Urocanat Hydratase
• Histidin Metabolismus
• URO
• Histidine metabolism
• urocanic acid

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