Molekulare Analysen zur Pluripotenz und Langzeitaktivität retroviral transduzierter hämatopoetischer Stammzellen

Adulte Blutstammzellen besitzen ein enormes Regenerationspotential. Ihre genaue Anzahl, Aktivitätsdauer sowie der quantitative Anteil individueller Klone an der Hämatopoese bei Großtieren oder dem Menschen sind jedoch nicht bekannt. Ob die Regenerationsfähigkeit auch Zelltypen außerhalb des hämatopoetischen Systems einschließt oder derartige Plastizitätsphänomene nur vorgetäuscht sind, ist derzeit unklar. Daher sind neue Methoden zur Analyse des in vivo Verhaltens von Stammzellen auf Einzelklonniveau notwendig. <br>In der vorliegenden Arbeit wurden erstmalig hochsensitive Methoden zur direkten quantitativen Klonalitätsanalyse individueller genmarkierter Stammzellen in einem HeLa-Tumorzellen-Modell entwickelt. Anschließend wurde die in vivo Hämatopoese eines mit transduzierten CD34+-Zellen transplantierten Rhesusaffen untersucht. Die genomische Integrationsstelle retroviraler Vektoren ist ein stabiler individueller DNA-Marker für jede transduzierte Zelle. Aus Leukozyten-DNA des Rhesusaffen wurden mehr als 80 Integrations-stellen durch ligationsmediierte PCRs identifiziert. Um aus dieser polyklonalen Population die Aktivität einzelner Stammzellklone direkt zu verfolgen, wurden klonspezifische PCR-Nachweise für vier Integrationsstellen etabliert. So konnte ein kontinuierlicher, langfristiger Beitrag individueller Stammzellklone zur Hämatopoese durch den Nachweis klonspezifischer DNA-Marker in kurzlebigen Granulozyten an 14 Zeitpunkten über 2 Jahre gezeigt werden. Zusätzlich wurden zwei dieser aus CD34+-Zellen hervorgegangenen Klone an mehreren Zeit-punkten simultan in hochreinen myeloischen und lymphatischen Zellpopulationen detektiert, sie haben folglich ihre Pluripotenz bewahrt. Ein weiterer langzeitaktiver Klon wurde nur in myeloischen Zellen gefunden, nicht jedoch in FACS-getrennten T- oder B-Zellen. Daher hat eine klonale Restriktion zur myeloischen Differenzierung stattgefunden oder es wurde ein myeloischer Progenitor transduziert. Jeder analysierte Klon steuerte 0,6-6% zur Gesamtgen-markierung bei, somit kann die Stammzellfrequenz im mobilisierten Blut des Rhesusaffen auf 2,5/107 mononukleäre Zellen geschätzt werden. Obwohl alle Klone langfristig stabil zur „steady state“ Hämatopoese beitrugen, wurde keiner der vier intensiv analysierten Klone früher als 6 Wochen nach der Transplantation detektiert. Vermutlich erfolgt die frühe Repopulation durch andere Zellgruppen wie vor kurzem entdeckten „Short Term Engraftern“. <br>Die Untersuchungsergebnisse erbrachten erstmalig den direkten molekularen Nachweis einer polyklonalen, pluripotenten und dauerhaften Hämatopoese durch individuelle Stammzellen in einem Großtiermodell. Kürzlich wurde die klinische Relevanz der vorgestellten Methoden zur Klonalitätsanalyse für künftige Stammzell- oder Gentherapien mit dem Nachweis einer Leukämieinduktion durch Insertionsmutagenese bei der SCID-X1 Gentherapie deutlich.

Author dc:creator

• Zickler, Philipp Patrick

Contributors dc:contributor

• Kalle, Christof von

• Pluripotenz
• retrovirale Transduktion
• Plastizität
• Genmarkierung
• LAM-PCR
• integration site analysis
• molecular tracking
• pluripotency
• hematopoietic stem cells

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