Charakterisierung der gamma-Untereinheiten AGG1 und AGG2 der heterotrimeren G-Proteine aus Arabidopsis thaliana

Mit spezifischen Antikörpern gegen AGG1 und AGG2 konnte gezeigt werden, dass AGG1 in der Membranfraktion von Arabidopsis-Infloreszenz- und Wurzelextrakten vorhanden ist, AGG2 im Gegensatz dazu ausschließlich in der Membranfraktion von Wurzelextrakten. Immunpräzipitationsversuche zeigten, dass beide Gg Untereinheiten in planta in den jeweiligen Organen mit AGB1 interagieren. Transiente Transformationsexperimente von Tabak-BY-2- und Arabidopsis-Protoplasten bestätigten die Lokalisierung an Membranen. Wird GFP-AGG1 allein exprimiert, befindet es sich hauptsächlich im Cytoplasma, die Koexpression von AGB1 bewirkt die Assoziation mit Membranen. GFP-AGG2 zeigt bereits bei alleiniger Expression eine deutliche Lokalisierung an der Plasmamembran. Bei beiden Untereinheiten ist die carboxyterminale CAAX-Box essentiell für die Membranständigkeit. In stabil transformierten Arabidopsis -Linien befinden sich GFP-AGG1- bzw. GFP-AGG2-Fusionsproteine an der Plasmamembran, CAAX-Box-Mutanten haben die Fähigkeit, an Membranen zu binden, verloren. Durch transgene Pflanzen, die b-Glucuronidase unter der Kontrolle von pAGG1 bzw. pAGG2 exprimieren, wurde festgestellt, dass die Promotoren in verschiedenen Geweben aktiv sind. AGG1 wird hauptsächlich in allen oberirdischen Pflanzenteilen exprimiert, während AGG2 fast ausschließlich in der Wurzel exprimiert wird. Um die Proteinexpression und -lokalisierung in planta genauer zu analysieren wurden transgene Linien hergestellt, die AGG1, AGG2 und die jeweiligen CAAX-Box-Mutanten als Fusionsproteine mit GFP bzw. EYFP unter der Kontrolle der endogenen Promotoren exprimieren. Mit einem yeast three hybrid-Screen wurde AtVAP28 als Interaktionspartner von AGG2 identifiziert. AtVAP28 ist ein t-SNARE-ähnliches Protein und knüpft eine Verbindung zwischen heterotrimeren G-Proteinen und Vesikeltransport in Wurzeln. Die Existenz zweier heterotrimerer G Protein-Komplexe in Arabidopsis konnte durch pull down-Experimente gezeigt werden. Es wurden transgene Linien hergestellt, die AGG1, AGG2 und AGB1 mit einem TAP-tag fusioniert exprimieren. Bei der Aufreinigung der Fusionsproteine konnten die anderen Untereinheiten angereichert werden. Um die Funktion von AGG1 untersuchen zu können, wurde eine T DNA-Insertionslinie molekularbiologisch analysiert und Arabidopsis-RNAi-Linien hergestellt, in denen die Expression von AGG1, AGG2 bzw. AGG1 und AGG2 herunterreguliert sein sollte.

Author dc:creator

• Hohenberger, Petra

Contributors dc:contributor

• Merkle, Thomas

• Interaktionspartner
• Funktion
• heterotrimere G-Proteine
• Arabidopsis thaliana
• heterotrimeric G Proteins
• Lokalisation
• interaction

Repository record source_url

https://freidok.uni-freiburg.de/data/1396

OAI identifier oai:identifier

oai:freidok.uni-freiburg.de:1396