{"id":{"repo_id":"freiburg-diss","oai_identifier":"oai:freidok.uni-freiburg.de:1318"},"canonical_url":"https://search.dev.ndltd.org/etd/freiburg-diss/oai:freidok.uni-freiburg.de:1318","repository":{"repo_id":"freiburg-diss","name":"University of Freiburg","base_url":"https://freidok.uni-freiburg.de/oai/oai2.php"},"display":{"title":"Mechanismen der Apoptose in proximalen Tubulusepithelzellen der Niere (LLC-PK1) : ein pathophysiologisches Modell für das hämolytisch-urämische Syndrom (HUS)","abstract":"Das hämolytisch-urämische Syndrom (HUS), die häufigste Ursache für ein akutes Nierenversagen im Kindes- und Jugendalter, ist in ca. 85% der Fälle mit einer Infektion durch enterohämorrhagischen Escherichia coli-Bakterien (EHEC) assoziiert. EHEC-Bakterien setzen Shigatoxine frei, die in vivo und in vitro renale Endo- und Epithelzellen schädigen.
Durch Beurteilung der Zellmorphologie, Bestimmung des Hämatoxylin-Labeling Index nach Hämatoxylinfärbung und Annexin-V-Immunfluoreszenzmikroskopie konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, daß sowohl Shigatoxin1 (Stx1) und als auch Shigatoxin2 (Stx2) toxisch auf proximale Tubulusepithelzellen der Niere (LLC-PK1) wirken und konzentrationsabhängig Apoptose auslösen: [Kontrolle: 10%, Stx1 0,1µg/ml: 14% (p>0,05), Stx1 0,5µg/ml: 29% (p<0,001) , Stx1 1,0µg/ml: 37% (p<0,001), Stx2 0,1µg/ ml: 21% (p<0,05), Stx2 0,5µg/ml: 33% (p<0,001), Stx2 1,0µg/ml: 41% (p<0,001)]. Shigatoxin2 besaß dabei ein stärkeres toxisches Potential als Shigatoxin1. Durch fluorometrisch markierte Anti-CD77-Antikörper konnte auf LLC-PK1-Zellen die Expression der funktionellen Shigatoxin- (Gb3-) Rezeptoren nachgewiesen werden. Es ist bekannt, daß TNF-alpha; die Expression von Gb3-Rezeptoren auf Endothelzellen steigert und dadurch die Shigatoxinwirkung verstärkt. Auf LLC-PK1-Zellen (Epithelzellen) dagegen steigerte die Vorbehandlung mit TNF-alpha (10ng/ml) die Gb3-Rezeptorexpression nur geringfügig. TNF-alpha (10ng/ml) löste ebenso wie Shigatoxine Apoptose aus (Kontrolle: 10%, TNF-alpha: 23%, p<0,001). Eine zusätzliche Verstärkung der Shigatoxinwirkung durch TNF-alpha konnte nur für niedrige Shigatoxin1-Konzentrationen (0,1µg/ml) nachgewiesen werden. Die Messung der Caspase-3-Aktivität mit fluorometrisch markiertem Caspase-3-Substrat ergab eine Aktivierung der „Effektor“-Caspase-3 durch Shigatoxin1 und 2. Nach Inkubation mit beiden Shigatoxinen führte eine gleichzeitige Behandlung mit Disulfiram (Tetraethylthiuram Disulfid), einem konzentrationsabhängigen Inhibitor der Caspase-3, in LLC-PK1-Zellen zu einem signifikant geringeren Anteil apoptotischer Zellen (Stx1: -19%, p<0,001 bzw. Stx2: -18,5%, p=0,04).
Diese zytoprotektiven Wirkungen von Caspase-3-Inhibitoren bei Shigatoxin-induzierter Apoptose eröffnen neue therapeutische Optionen für das HUS.","abstract_html":"Das hämolytisch-urämische Syndrom (HUS), die häufigste Ursache für ein akutes Nierenversagen im Kindes- und Jugendalter, ist in ca. 85% der Fälle mit einer Infektion durch enterohämorrhagischen Escherichia coli-Bakterien (EHEC) assoziiert. EHEC-Bakterien setzen Shigatoxine frei, die in vivo und in vitro renale Endo- und Epithelzellen schädigen. <br>Durch Beurteilung der Zellmorphologie, Bestimmung des Hämatoxylin-Labeling Index nach Hämatoxylinfärbung und Annexin-V-Immunfluoreszenzmikroskopie konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, daß sowohl Shigatoxin1 (Stx1) und als auch Shigatoxin2 (Stx2) toxisch auf proximale Tubulusepithelzellen der Niere (LLC-PK1) wirken und konzentrationsabhängig Apoptose auslösen: [Kontrolle: 10%, Stx1 0,1µg/ml: 14% (p>0,05), Stx1 0,5µg/ml: 29% (p<0,001) , Stx1 1,0µg/ml: 37% (p<0,001), Stx2 0,1µg/ ml: 21% (p<0,05), Stx2 0,5µg/ml: 33% (p<0,001), Stx2 1,0µg/ml: 41% (p<0,001)]. Shigatoxin2 besaß dabei ein stärkeres toxisches Potential als Shigatoxin1. Durch fluorometrisch markierte Anti-CD77-Antikörper konnte auf LLC-PK1-Zellen die Expression der funktionellen Shigatoxin- (Gb3-) Rezeptoren nachgewiesen werden. Es ist bekannt, daß TNF-alpha; die Expression von Gb3-Rezeptoren auf Endothelzellen steigert und dadurch die Shigatoxinwirkung verstärkt. Auf LLC-PK1-Zellen (Epithelzellen) dagegen steigerte die Vorbehandlung mit TNF-alpha (10ng/ml) die Gb3-Rezeptorexpression nur geringfügig. TNF-alpha (10ng/ml) löste ebenso wie Shigatoxine Apoptose aus (Kontrolle: 10%, TNF-alpha: 23%, p<0,001). Eine zusätzliche Verstärkung der Shigatoxinwirkung durch TNF-alpha konnte nur für niedrige Shigatoxin1-Konzentrationen (0,1µg/ml) nachgewiesen werden. Die Messung der Caspase-3-Aktivität mit fluorometrisch markiertem Caspase-3-Substrat ergab eine Aktivierung der „Effektor“-Caspase-3 durch Shigatoxin1 und 2. Nach Inkubation mit beiden Shigatoxinen führte eine gleichzeitige Behandlung mit Disulfiram (Tetraethylthiuram Disulfid), einem konzentrationsabhängigen Inhibitor der Caspase-3, in LLC-PK1-Zellen zu einem signifikant geringeren Anteil apoptotischer Zellen (Stx1: -19%, p<0,001 bzw. Stx2: -18,5%, p=0,04). <br>Diese zytoprotektiven Wirkungen von Caspase-3-Inhibitoren bei Shigatoxin-induzierter Apoptose eröffnen neue therapeutische Optionen für das HUS.","abstract_has_math":false,"creators":["Nowack, Klaus"],"institution":null,"degree_name":null,"degree_level":null,"degree_discipline":null,"degree_department":null,"school":null,"contributors":["Zimmerhackl, Lothar Bernd"],"advisors":[],"committee_chairs":[],"committee_members":[],"year":null,"date_issued":"","date_published":null,"updated_at":"2026-07-24T02:22:10Z","subjects":["Apoptose","Shigatoxine","Caspase-3","apoptosis","shigatoxin"],"languages":[],"rights":[],"rights_urls":[],"identifier_entries":[]},"links":{"outbound_url":"https://freidok.uni-freiburg.de/data/1318","outbound_label":"Repository record","outbound_source":"source_url"},"metadata_groups":[{"id":"people","label":"People","entries":[{"key":"dc:contributor","label":"Contributor","values":["Zimmerhackl, Lothar Bernd"]},{"key":"dc:creator","label":"Author","values":["Nowack, Klaus"]}]},{"id":"academic_context","label":"Academic Context","entries":[{"key":"dc:type","label":"Dc Type","values":["DoctoralThesis"]}]},{"id":"subjects_keywords","label":"Subjects and Keywords","entries":[{"key":"dc:subject","label":"Dc Subject","values":["Apoptose","Shigatoxine","Caspase-3","apoptosis","shigatoxin"]}]},{"id":"additional","label":"Additional Metadata","entries":[{"key":"dc:description.abstract","label":"Abstract","values":["Das hämolytisch-urämische Syndrom (HUS), die häufigste Ursache für ein akutes Nierenversagen im Kindes- und Jugendalter, ist in ca. 85% der Fälle mit einer Infektion durch enterohämorrhagischen Escherichia coli-Bakterien (EHEC) assoziiert. EHEC-Bakterien setzen Shigatoxine frei, die in vivo und in vitro renale Endo- und Epithelzellen schädigen.
Durch Beurteilung der Zellmorphologie, Bestimmung des Hämatoxylin-Labeling Index nach Hämatoxylinfärbung und Annexin-V-Immunfluoreszenzmikroskopie konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, daß sowohl Shigatoxin1 (Stx1) und als auch Shigatoxin2 (Stx2) toxisch auf proximale Tubulusepithelzellen der Niere (LLC-PK1) wirken und konzentrationsabhängig Apoptose auslösen: [Kontrolle: 10%, Stx1 0,1µg/ml: 14% (p>0,05), Stx1 0,5µg/ml: 29% (p<0,001) , Stx1 1,0µg/ml: 37% (p<0,001), Stx2 0,1µg/ ml: 21% (p<0,05), Stx2 0,5µg/ml: 33% (p<0,001), Stx2 1,0µg/ml: 41% (p<0,001)]. Shigatoxin2 besaß dabei ein stärkeres toxisches Potential als Shigatoxin1. Durch fluorometrisch markierte Anti-CD77-Antikörper konnte auf LLC-PK1-Zellen die Expression der funktionellen Shigatoxin- (Gb3-) Rezeptoren nachgewiesen werden. Es ist bekannt, daß TNF-alpha; die Expression von Gb3-Rezeptoren auf Endothelzellen steigert und dadurch die Shigatoxinwirkung verstärkt. Auf LLC-PK1-Zellen (Epithelzellen) dagegen steigerte die Vorbehandlung mit TNF-alpha (10ng/ml) die Gb3-Rezeptorexpression nur geringfügig. TNF-alpha (10ng/ml) löste ebenso wie Shigatoxine Apoptose aus (Kontrolle: 10%, TNF-alpha: 23%, p<0,001). Eine zusätzliche Verstärkung der Shigatoxinwirkung durch TNF-alpha konnte nur für niedrige Shigatoxin1-Konzentrationen (0,1µg/ml) nachgewiesen werden. Die Messung der Caspase-3-Aktivität mit fluorometrisch markiertem Caspase-3-Substrat ergab eine Aktivierung der „Effektor“-Caspase-3 durch Shigatoxin1 und 2. Nach Inkubation mit beiden Shigatoxinen führte eine gleichzeitige Behandlung mit Disulfiram (Tetraethylthiuram Disulfid), einem konzentrationsabhängigen Inhibitor der Caspase-3, in LLC-PK1-Zellen zu einem signifikant geringeren Anteil apoptotischer Zellen (Stx1: -19%, p<0,001 bzw. Stx2: -18,5%, p=0,04).
Diese zytoprotektiven Wirkungen von Caspase-3-Inhibitoren bei Shigatoxin-induzierter Apoptose eröffnen neue therapeutische Optionen für das HUS.","The Hemolytic Uremic-Syndrome (HUS) is the major cause for acute renal failure in children. HUS is predominantly associated with Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) infection. In this context, the release of shigatoxins (Stx) by EHEC is thought to be the major pathogenic mechanism.
The aim of our study was to get more information about the role of Stx and Tumor Necrosis Factor-alpha (TNF-alpha) in the pathophysiology of HUS and to define more precisely the mode of Shigatoxin-induced cell death with special regard to the path by which cell death/apoptosis is generated.
In LLC-PK1-cells, a cell line from the kidney of a Hampshire pig, that is well established and generally accepted as a model of proximal tubular epithelial cells, Stx 1 and Stx 2 caused apoptosis in a concentration dependent manner, as demostrated by analysis of cell-morphology, Annexin-V-immunfluorescence-microscopy and Hematoxylin-Staining. In this context, Stx2 was shown to be more toxic than Stx 1.
Occurrence of Gb3-receptors, the functional receptors for Stx, on the surface of LLC-PK1-cells, has been shown by Anti-CD77-immunfluorescencemicroscopy.
In endothelial cells, pre-incubation with TNF-alpha increased Stx-induced apoptosis through an increased density of Gb3–receptors on the cell surface. In contrast, in LLC-PK1-cells (epithelial cells) incubation with TNF-alpha induced apoptosis, slightly increased the number of Gb3-receptors, and boosted Stx-induced apoptosis at low concentrations of Stx1 only.
In our cell model Stx 1 and Stx 2 caused activation of effective caspase-3, as indicated by the fluorometric PhiPhiLux-Caspase-3-activity assay. As demostrated by Annexin-V-immunfluorescence and Hematoxylin-Staining in LLC-PK1-cells, apoptosis induced by exposure to Stx 1 and Stx2 could be inhibited by incubation with Tetraethyldisulfid (TED, Disulfiram). This substance was was shown to be a caspase inhibitor.
This cytoprotective effects of the Caspase inhibitor TED in Stx-induced apoptosis may open new aspects and options in the therapy of HUS."]},{"key":"dc:format.medium","label":"Dc Format Medium","values":["application/pdf"]},{"key":"dc:title","label":"Title","values":["Mechanismen der Apoptose in proximalen Tubulusepithelzellen der Niere (LLC-PK1) : ein pathophysiologisches Modell für das hämolytisch-urämische Syndrom (HUS)","Mechanisms of apoptosis in proximal tubular epithelial cells (LLC-PK1) : a model for the Hemolytic Uremic Syndrome (HUS)"]}]}],"canonical_facts":{"dc:contributor":["Zimmerhackl, Lothar Bernd"],"dc:creator":["Nowack, Klaus"],"dc:description.abstract":["Das hämolytisch-urämische Syndrom (HUS), die häufigste Ursache für ein akutes Nierenversagen im Kindes- und Jugendalter, ist in ca. 85% der Fälle mit einer Infektion durch enterohämorrhagischen Escherichia coli-Bakterien (EHEC) assoziiert. EHEC-Bakterien setzen Shigatoxine frei, die in vivo und in vitro renale Endo- und Epithelzellen schädigen.
Durch Beurteilung der Zellmorphologie, Bestimmung des Hämatoxylin-Labeling Index nach Hämatoxylinfärbung und Annexin-V-Immunfluoreszenzmikroskopie konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, daß sowohl Shigatoxin1 (Stx1) und als auch Shigatoxin2 (Stx2) toxisch auf proximale Tubulusepithelzellen der Niere (LLC-PK1) wirken und konzentrationsabhängig Apoptose auslösen: [Kontrolle: 10%, Stx1 0,1µg/ml: 14% (p>0,05), Stx1 0,5µg/ml: 29% (p<0,001) , Stx1 1,0µg/ml: 37% (p<0,001), Stx2 0,1µg/ ml: 21% (p<0,05), Stx2 0,5µg/ml: 33% (p<0,001), Stx2 1,0µg/ml: 41% (p<0,001)]. Shigatoxin2 besaß dabei ein stärkeres toxisches Potential als Shigatoxin1. Durch fluorometrisch markierte Anti-CD77-Antikörper konnte auf LLC-PK1-Zellen die Expression der funktionellen Shigatoxin- (Gb3-) Rezeptoren nachgewiesen werden. Es ist bekannt, daß TNF-alpha; die Expression von Gb3-Rezeptoren auf Endothelzellen steigert und dadurch die Shigatoxinwirkung verstärkt. Auf LLC-PK1-Zellen (Epithelzellen) dagegen steigerte die Vorbehandlung mit TNF-alpha (10ng/ml) die Gb3-Rezeptorexpression nur geringfügig. TNF-alpha (10ng/ml) löste ebenso wie Shigatoxine Apoptose aus (Kontrolle: 10%, TNF-alpha: 23%, p<0,001). Eine zusätzliche Verstärkung der Shigatoxinwirkung durch TNF-alpha konnte nur für niedrige Shigatoxin1-Konzentrationen (0,1µg/ml) nachgewiesen werden. Die Messung der Caspase-3-Aktivität mit fluorometrisch markiertem Caspase-3-Substrat ergab eine Aktivierung der „Effektor“-Caspase-3 durch Shigatoxin1 und 2. Nach Inkubation mit beiden Shigatoxinen führte eine gleichzeitige Behandlung mit Disulfiram (Tetraethylthiuram Disulfid), einem konzentrationsabhängigen Inhibitor der Caspase-3, in LLC-PK1-Zellen zu einem signifikant geringeren Anteil apoptotischer Zellen (Stx1: -19%, p<0,001 bzw. Stx2: -18,5%, p=0,04).
Diese zytoprotektiven Wirkungen von Caspase-3-Inhibitoren bei Shigatoxin-induzierter Apoptose eröffnen neue therapeutische Optionen für das HUS.","The Hemolytic Uremic-Syndrome (HUS) is the major cause for acute renal failure in children. HUS is predominantly associated with Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) infection. In this context, the release of shigatoxins (Stx) by EHEC is thought to be the major pathogenic mechanism.
The aim of our study was to get more information about the role of Stx and Tumor Necrosis Factor-alpha (TNF-alpha) in the pathophysiology of HUS and to define more precisely the mode of Shigatoxin-induced cell death with special regard to the path by which cell death/apoptosis is generated.
In LLC-PK1-cells, a cell line from the kidney of a Hampshire pig, that is well established and generally accepted as a model of proximal tubular epithelial cells, Stx 1 and Stx 2 caused apoptosis in a concentration dependent manner, as demostrated by analysis of cell-morphology, Annexin-V-immunfluorescence-microscopy and Hematoxylin-Staining. In this context, Stx2 was shown to be more toxic than Stx 1.
Occurrence of Gb3-receptors, the functional receptors for Stx, on the surface of LLC-PK1-cells, has been shown by Anti-CD77-immunfluorescencemicroscopy.
In endothelial cells, pre-incubation with TNF-alpha increased Stx-induced apoptosis through an increased density of Gb3–receptors on the cell surface. In contrast, in LLC-PK1-cells (epithelial cells) incubation with TNF-alpha induced apoptosis, slightly increased the number of Gb3-receptors, and boosted Stx-induced apoptosis at low concentrations of Stx1 only.
In our cell model Stx 1 and Stx 2 caused activation of effective caspase-3, as indicated by the fluorometric PhiPhiLux-Caspase-3-activity assay. As demostrated by Annexin-V-immunfluorescence and Hematoxylin-Staining in LLC-PK1-cells, apoptosis induced by exposure to Stx 1 and Stx2 could be inhibited by incubation with Tetraethyldisulfid (TED, Disulfiram). This substance was was shown to be a caspase inhibitor.
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