Etablierung einer Zellkultur aus unterschiedlichen humanen Herzmuskelgeweben sowie die Simulation von verschiedenen Mangelzuständen in vitro
Ziel meiner Dissertation war es, eine Zellkultur aus unterschiedlichen humanen Herzmuskelgeweben zu etablieren und verschiedene Mangelzustände in vitro zu simulieren. Dazu wurden Patienten während eines herzchirurgischen Eingriffes Probebiopsien aus verschiedenen Herzregionen entnommen. Ein Teil dieser Biopsien wurde direkt zu Gesamt-RNA aufgearbeitet, um die Genexpression unter pathologischen Umständen am Herzen nachvollziehen zu können. Durch die RT-PCR wurden spezifische Fragmente amplifiziert, die man durch die jeweiligen Primer nachwies und in der Gelelektrophorese analysierte. Die andere Hälfte der Myokardbiopsie wurde mit Kollagenase verdaut und die Zellen wurden in Kultur genommen. Nach mehrmaligem Passagieren züchtete man aus derselben Passage stammende Zellen parallel in Flaschen und auf Deckgläschen an und inkubierte für 12, 24, 48 bzw. 72 Stunden mit Medium und den jeweiligen Zusätzen (Serum, Insulin und Wachstumsfaktoren). Die Zellen in den Flaschen erntete man nach Ende des jeweiligen Induktionsversuches, RNA und Proteine wurden extrahiert und in der RT-PCR bzw. im Western-Blot analysiert. Anschließend wurde die Genexpression in der Zellkultur mit der in den Patientenproben sowie der der beiden Kontrollen verglichen. Als Positivkontrolle diente die fötale Kardiomyozyten-Zelllinie cmc 5097. Die Negativkontrolle stellten HepG2-Zellen, Zellen aus menschlichem hepatozellulärem Karzinom, dar. Die auf den Deckgläschen angezüchteten Zellen wurden ebenfalls induziert und für die Immunfluoreszenz verwandt. Es gelang, Zellen aus humanen Probebiopsien, die aus verschiedenen Herzregionen stammten, in Kultur zu nehmen und anzuzüchten. Hierbei kam es zu einem Wachstum der Vorhof-, rechts- sowie linksventrikulären Zellen in gleichem Ausmaß. Der Nachweis des Vorhandenseins von Kardiomyozyten erfolgte durch immunhistochemische Darstellung spezifischer intrazellulärer Strukturen, die Proteine des kontraktilen Materials sowie des Zytoskeletts repräsentierten. In der Immunfluoreszenz wurden selektiv alpha-sarcomeric-Actin, F-Actin und alpha-Actinin nachgewiesen, ferner wurde die Genexpression der myozytenspezifischen Gene hANP, hBNP, GATA-4, Serca 2, Ryanodin 2, Phospholamban und NCX in der RT-PCR bestimmt. Im Western-Blot konnte zusätzlich Serca 2a nachgewiesen werden. Bei den einzelnen Induktionsversuchen fiel auf, dass für ein optimales Wachstum der Zellen der Zusatz von Serum nötig war. Bei Nichtvorhandensein bzw. Entzug des Serums stagnierte das Zellwachstum bereits nach zwei Tagen. Der Vergleich unbehandelte Patientenbiopsieanteile zu in Kultur genommene und induzierte Zellen zeigte, dass hANP, Ryanodin 2, NCX und Phospholamban in den unbehandelten Biopsien exprimiert wurden, bei den induzierten Zellen zunächst jedoch kein einheitliches Signal nachgewiesen werden konnte. Verglich man die Genexpression eines einzelnen Faktors zu verschiedenen Zeitpunkten, erkannte man, dass die Expression von Serca 2, A-Raf, bFGF, VEGF und GATA-4 nach 24 Stunden durchwegs positiv war, nach zwei- bzw. dreitägiger Induktion die Gene jedoch in allen Versuchen nicht mehr dokumentiert werden konnten. hANP wurde nach 48 Stunden, hBNP und Ryanodin 2 erst nach 72 Stunden exprimiert. Es konnte mit zunehmender Induktionsdauer eine veränderte Genexpression nachgewiesen werden. hANP, Ryanodin 2 und hBNP stellten somit sensitive Hypoxiemarker in den Versuchen dar. Somit gelang es, aus entnommenen humanen Myokardbiopsien Primärkulturen mit Kardiomyozyten zu etablieren. Durch die Induktionsversuche konnte nachgewiesen werden, dass für ein optimales Wachstum der Zellen Serum (10% FBS), Insulin und Wachstumsfaktoren (hFGF-B, hEGF) nötig waren. Im Zeitintervall nach 24 Stunden entsprachen die Expressionsmuster in den Zellkulturen unter allen Stresssituationen den der unbehandelten Patientenbiopsien. Somit konnte unter diesen Bedingungen der Zustand der myokardialen Hypoxie bei koronarer Herzkrankheit in der Kultur reproduziert werden. Hierzu war bereits der Entzug einer Mediumkomponente – Serum, Insulin oder Wachstumsfaktoren (hFGF-B und hEGF) – in der Kultur ausreichend. Um eine repräsentative Simulation der Hypoxie in Kultur zu erzielen, reichte eine 24 Stunden-Induktion aus. Hypoxische Bedingungen am Herzen konnten somit detailiert und abhängig von der gezielten Fragestellung in der Kardiomyozytenkultur untersucht werden.
Mangelzustand, Induktionsversuch, cell culture, heart muscle, hypoxia, coronary heart disease
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