{"id":{"repo_id":"freiburg-diss","oai_identifier":"oai:freidok.uni-freiburg.de:1301"},"canonical_url":"https://search.dev.ndltd.org/etd/freiburg-diss/oai:freidok.uni-freiburg.de:1301","repository":{"repo_id":"freiburg-diss","name":"University of Freiburg","base_url":"https://freidok.uni-freiburg.de/oai/oai2.php"},"display":{"title":"Etablierung einer Zellkultur aus unterschiedlichen humanen Herzmuskelgeweben sowie die Simulation von verschiedenen Mangelzuständen in vitro","abstract":"Ziel meiner Dissertation war es, eine Zellkultur aus unterschiedlichen humanen Herzmuskelgeweben zu etablieren und verschiedene Mangelzustände in vitro zu simulieren.
Dazu wurden Patienten während eines herzchirurgischen Eingriffes Probebiopsien aus verschiedenen Herzregionen entnommen. Ein Teil dieser Biopsien wurde direkt zu Gesamt-RNA aufgearbeitet, um die Genexpression unter pathologischen Umständen am Herzen nachvollziehen zu können. Durch die RT-PCR wurden spezifische Fragmente amplifiziert, die man durch die jeweiligen Primer nachwies und in der Gelelektrophorese analysierte. Die andere Hälfte der Myokardbiopsie wurde mit Kollagenase verdaut und die Zellen wurden in Kultur genommen. Nach mehrmaligem Passagieren züchtete man aus derselben Passage stammende Zellen parallel in Flaschen und auf Deckgläschen an und inkubierte für 12, 24, 48 bzw. 72 Stunden mit Medium und den jeweiligen Zusätzen (Serum, Insulin und Wachstumsfaktoren).
Die Zellen in den Flaschen erntete man nach Ende des jeweiligen Induktionsversuches, RNA und Proteine wurden extrahiert und in der RT-PCR bzw. im Western-Blot analysiert.
Anschließend wurde die Genexpression in der Zellkultur mit der in den Patientenproben sowie der der beiden Kontrollen verglichen.
Als Positivkontrolle diente die fötale Kardiomyozyten-Zelllinie cmc 5097. Die Negativkontrolle stellten HepG2-Zellen, Zellen aus menschlichem hepatozellulärem
Karzinom, dar. Die auf den Deckgläschen angezüchteten Zellen wurden ebenfalls induziert und für die Immunfluoreszenz verwandt.
Es gelang, Zellen aus humanen Probebiopsien, die aus verschiedenen Herzregionen stammten, in Kultur zu nehmen und anzuzüchten. Hierbei kam es zu einem Wachstum der Vorhof-, rechts- sowie linksventrikulären Zellen in gleichem Ausmaß.
Der Nachweis des Vorhandenseins von Kardiomyozyten erfolgte durch immunhistochemische Darstellung spezifischer intrazellulärer Strukturen, die Proteine des kontraktilen Materials sowie des Zytoskeletts repräsentierten. In der Immunfluoreszenz wurden selektiv alpha-sarcomeric-Actin, F-Actin und alpha-Actinin nachgewiesen, ferner wurde die Genexpression der myozytenspezifischen Gene hANP, hBNP, GATA-4, Serca 2, Ryanodin 2, Phospholamban und NCX in der RT-PCR bestimmt. Im Western-Blot konnte zusätzlich Serca 2a nachgewiesen werden.
Bei den einzelnen Induktionsversuchen fiel auf, dass für ein optimales Wachstum der Zellen der Zusatz von Serum nötig war. Bei Nichtvorhandensein bzw. Entzug des Serums stagnierte das Zellwachstum bereits nach zwei Tagen.
Der Vergleich unbehandelte Patientenbiopsieanteile zu in Kultur genommene und induzierte Zellen zeigte, dass hANP, Ryanodin 2, NCX und Phospholamban in den unbehandelten Biopsien exprimiert wurden, bei den induzierten Zellen zunächst jedoch kein einheitliches Signal nachgewiesen werden konnte.
Verglich man die Genexpression eines einzelnen Faktors zu verschiedenen Zeitpunkten, erkannte man, dass die Expression von Serca 2, A-Raf, bFGF, VEGF und GATA-4 nach 24 Stunden durchwegs positiv war, nach zwei- bzw. dreitägiger Induktion die Gene jedoch in allen Versuchen nicht mehr dokumentiert werden konnten.
hANP wurde nach 48 Stunden, hBNP und Ryanodin 2 erst nach 72 Stunden exprimiert.
Es konnte mit zunehmender Induktionsdauer eine veränderte Genexpression nachgewiesen werden. hANP, Ryanodin 2 und hBNP stellten somit sensitive Hypoxiemarker in den Versuchen dar.
Somit gelang es, aus entnommenen humanen Myokardbiopsien Primärkulturen mit Kardiomyozyten zu etablieren.
Durch die Induktionsversuche konnte nachgewiesen werden, dass für ein optimales Wachstum der Zellen Serum (10% FBS), Insulin und Wachstumsfaktoren (hFGF-B, hEGF) nötig waren.
Im Zeitintervall nach 24 Stunden entsprachen die Expressionsmuster in den Zellkulturen unter allen Stresssituationen den der unbehandelten Patientenbiopsien. Somit konnte unter diesen Bedingungen der Zustand der myokardialen Hypoxie bei koronarer Herzkrankheit in der Kultur reproduziert werden. Hierzu war bereits der Entzug einer Mediumkomponente – Serum, Insulin oder Wachstumsfaktoren (hFGF-B und hEGF) – in der Kultur ausreichend.
Um eine repräsentative Simulation der Hypoxie in Kultur zu erzielen, reichte eine 24 Stunden-Induktion aus.
Hypoxische Bedingungen am Herzen konnten somit detailiert und abhängig von der gezielten Fragestellung in der Kardiomyozytenkultur untersucht werden.","abstract_html":"Ziel meiner Dissertation war es, eine Zellkultur aus unterschiedlichen humanen Herzmuskelgeweben zu etablieren und verschiedene Mangelzustände in vitro zu simulieren. <br>Dazu wurden Patienten während eines herzchirurgischen Eingriffes Probebiopsien aus verschiedenen Herzregionen entnommen. Ein Teil dieser Biopsien wurde direkt zu Gesamt-RNA aufgearbeitet, um die Genexpression unter pathologischen Umständen am Herzen nachvollziehen zu können. Durch die RT-PCR wurden spezifische Fragmente amplifiziert, die man durch die jeweiligen Primer nachwies und in der Gelelektrophorese analysierte. Die andere Hälfte der Myokardbiopsie wurde mit Kollagenase verdaut und die Zellen wurden in Kultur genommen. Nach mehrmaligem Passagieren züchtete man aus derselben Passage stammende Zellen parallel in Flaschen und auf Deckgläschen an und inkubierte für 12, 24, 48 bzw. 72 Stunden mit Medium und den jeweiligen Zusätzen (Serum, Insulin und Wachstumsfaktoren). <br>Die Zellen in den Flaschen erntete man nach Ende des jeweiligen Induktionsversuches, RNA und Proteine wurden extrahiert und in der RT-PCR bzw. im Western-Blot analysiert. <br>Anschließend wurde die Genexpression in der Zellkultur mit der in den Patientenproben sowie der der beiden Kontrollen verglichen. <br>Als Positivkontrolle diente die fötale Kardiomyozyten-Zelllinie cmc 5097. Die Negativkontrolle stellten HepG2-Zellen, Zellen aus menschlichem hepatozellulärem <br>Karzinom, dar. Die auf den Deckgläschen angezüchteten Zellen wurden ebenfalls induziert und für die Immunfluoreszenz verwandt. <br>Es gelang, Zellen aus humanen Probebiopsien, die aus verschiedenen Herzregionen stammten, in Kultur zu nehmen und anzuzüchten. Hierbei kam es zu einem Wachstum der Vorhof-, rechts- sowie linksventrikulären Zellen in gleichem Ausmaß. <br>Der Nachweis des Vorhandenseins von Kardiomyozyten erfolgte durch immunhistochemische Darstellung spezifischer intrazellulärer Strukturen, die Proteine des kontraktilen Materials sowie des Zytoskeletts repräsentierten. In der Immunfluoreszenz wurden selektiv alpha-sarcomeric-Actin, F-Actin und alpha-Actinin nachgewiesen, ferner wurde die Genexpression der myozytenspezifischen Gene hANP, hBNP, GATA-4, Serca 2, Ryanodin 2, Phospholamban und NCX in der RT-PCR bestimmt. Im Western-Blot konnte zusätzlich Serca 2a nachgewiesen werden. <br>Bei den einzelnen Induktionsversuchen fiel auf, dass für ein optimales Wachstum der Zellen der Zusatz von Serum nötig war. Bei Nichtvorhandensein bzw. Entzug des Serums stagnierte das Zellwachstum bereits nach zwei Tagen. <br>Der Vergleich unbehandelte Patientenbiopsieanteile zu in Kultur genommene und induzierte Zellen zeigte, dass hANP, Ryanodin 2, NCX und Phospholamban in den unbehandelten Biopsien exprimiert wurden, bei den induzierten Zellen zunächst jedoch kein einheitliches Signal nachgewiesen werden konnte. <br>Verglich man die Genexpression eines einzelnen Faktors zu verschiedenen Zeitpunkten, erkannte man, dass die Expression von Serca 2, A-Raf, bFGF, VEGF und GATA-4 nach 24 Stunden durchwegs positiv war, nach zwei- bzw. dreitägiger Induktion die Gene jedoch in allen Versuchen nicht mehr dokumentiert werden konnten. <br>hANP wurde nach 48 Stunden, hBNP und Ryanodin 2 erst nach 72 Stunden exprimiert. <br>Es konnte mit zunehmender Induktionsdauer eine veränderte Genexpression nachgewiesen werden. hANP, Ryanodin 2 und hBNP stellten somit sensitive Hypoxiemarker in den Versuchen dar. <br>Somit gelang es, aus entnommenen humanen Myokardbiopsien Primärkulturen mit Kardiomyozyten zu etablieren. <br>Durch die Induktionsversuche konnte nachgewiesen werden, dass für ein optimales Wachstum der Zellen Serum (10% FBS), Insulin und Wachstumsfaktoren (hFGF-B, hEGF) nötig waren. <br>Im Zeitintervall nach 24 Stunden entsprachen die Expressionsmuster in den Zellkulturen unter allen Stresssituationen den der unbehandelten Patientenbiopsien. Somit konnte unter diesen Bedingungen der Zustand der myokardialen Hypoxie bei koronarer Herzkrankheit in der Kultur reproduziert werden. Hierzu war bereits der Entzug einer Mediumkomponente – Serum, Insulin oder Wachstumsfaktoren (hFGF-B und hEGF) – in der Kultur ausreichend. <br>Um eine repräsentative Simulation der Hypoxie in Kultur zu erzielen, reichte eine 24 Stunden-Induktion aus. <br>Hypoxische Bedingungen am Herzen konnten somit detailiert und abhängig von der gezielten Fragestellung in der Kardiomyozytenkultur untersucht werden.","abstract_has_math":false,"creators":["Lehner, Christoph"],"institution":null,"degree_name":null,"degree_level":null,"degree_discipline":null,"degree_department":null,"school":null,"contributors":["Holubarsch, Christian J. 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Dazu wurden Patienten während eines herzchirurgischen Eingriffes Probebiopsien aus verschiedenen Herzregionen entnommen. Ein Teil dieser Biopsien wurde direkt zu Gesamt-RNA aufgearbeitet, um die Genexpression unter pathologischen Umständen am Herzen nachvollziehen zu können. Durch die RT-PCR wurden spezifische Fragmente amplifiziert, die man durch die jeweiligen Primer nachwies und in der Gelelektrophorese analysierte. Die andere Hälfte der Myokardbiopsie wurde mit Kollagenase verdaut und die Zellen wurden in Kultur genommen. Nach mehrmaligem Passagieren züchtete man aus derselben Passage stammende Zellen parallel in Flaschen und auf Deckgläschen an und inkubierte für 12, 24, 48 bzw. 72 Stunden mit Medium und den jeweiligen Zusätzen (Serum, Insulin und Wachstumsfaktoren).
Die Zellen in den Flaschen erntete man nach Ende des jeweiligen Induktionsversuches, RNA und Proteine wurden extrahiert und in der RT-PCR bzw. im Western-Blot analysiert.
Anschließend wurde die Genexpression in der Zellkultur mit der in den Patientenproben sowie der der beiden Kontrollen verglichen.
Als Positivkontrolle diente die fötale Kardiomyozyten-Zelllinie cmc 5097. Die Negativkontrolle stellten HepG2-Zellen, Zellen aus menschlichem hepatozellulärem
Karzinom, dar. Die auf den Deckgläschen angezüchteten Zellen wurden ebenfalls induziert und für die Immunfluoreszenz verwandt.
Es gelang, Zellen aus humanen Probebiopsien, die aus verschiedenen Herzregionen stammten, in Kultur zu nehmen und anzuzüchten. Hierbei kam es zu einem Wachstum der Vorhof-, rechts- sowie linksventrikulären Zellen in gleichem Ausmaß.
Der Nachweis des Vorhandenseins von Kardiomyozyten erfolgte durch immunhistochemische Darstellung spezifischer intrazellulärer Strukturen, die Proteine des kontraktilen Materials sowie des Zytoskeletts repräsentierten. In der Immunfluoreszenz wurden selektiv alpha-sarcomeric-Actin, F-Actin und alpha-Actinin nachgewiesen, ferner wurde die Genexpression der myozytenspezifischen Gene hANP, hBNP, GATA-4, Serca 2, Ryanodin 2, Phospholamban und NCX in der RT-PCR bestimmt. Im Western-Blot konnte zusätzlich Serca 2a nachgewiesen werden.
Bei den einzelnen Induktionsversuchen fiel auf, dass für ein optimales Wachstum der Zellen der Zusatz von Serum nötig war. Bei Nichtvorhandensein bzw. Entzug des Serums stagnierte das Zellwachstum bereits nach zwei Tagen.
Der Vergleich unbehandelte Patientenbiopsieanteile zu in Kultur genommene und induzierte Zellen zeigte, dass hANP, Ryanodin 2, NCX und Phospholamban in den unbehandelten Biopsien exprimiert wurden, bei den induzierten Zellen zunächst jedoch kein einheitliches Signal nachgewiesen werden konnte.
Verglich man die Genexpression eines einzelnen Faktors zu verschiedenen Zeitpunkten, erkannte man, dass die Expression von Serca 2, A-Raf, bFGF, VEGF und GATA-4 nach 24 Stunden durchwegs positiv war, nach zwei- bzw. dreitägiger Induktion die Gene jedoch in allen Versuchen nicht mehr dokumentiert werden konnten.
hANP wurde nach 48 Stunden, hBNP und Ryanodin 2 erst nach 72 Stunden exprimiert.
Es konnte mit zunehmender Induktionsdauer eine veränderte Genexpression nachgewiesen werden. hANP, Ryanodin 2 und hBNP stellten somit sensitive Hypoxiemarker in den Versuchen dar.
Somit gelang es, aus entnommenen humanen Myokardbiopsien Primärkulturen mit Kardiomyozyten zu etablieren.
Durch die Induktionsversuche konnte nachgewiesen werden, dass für ein optimales Wachstum der Zellen Serum (10% FBS), Insulin und Wachstumsfaktoren (hFGF-B, hEGF) nötig waren.
Im Zeitintervall nach 24 Stunden entsprachen die Expressionsmuster in den Zellkulturen unter allen Stresssituationen den der unbehandelten Patientenbiopsien. Somit konnte unter diesen Bedingungen der Zustand der myokardialen Hypoxie bei koronarer Herzkrankheit in der Kultur reproduziert werden. Hierzu war bereits der Entzug einer Mediumkomponente – Serum, Insulin oder Wachstumsfaktoren (hFGF-B und hEGF) – in der Kultur ausreichend.
Um eine repräsentative Simulation der Hypoxie in Kultur zu erzielen, reichte eine 24 Stunden-Induktion aus.
Hypoxische Bedingungen am Herzen konnten somit detailiert und abhängig von der gezielten Fragestellung in der Kardiomyozytenkultur untersucht werden.","The aim of my dissertation was to establish a primary cell culture of different human heart muscle tissues and to simulate various conditions of deficiency in vitro.
Ventricular and artrial biopsies were taken from patients during cardiac surgery. One part of these biopsies was directly processed to total-RNA to comprehend gene expression under pathological circumstances. Specific fragments were amplified with RT-PCR and consequently detected by respective primers. Thereupon analysis followed by gel electrophoresis. The other part of myocardiac biopsies was incubated with collagenase and the cells were put in culture. After several passages cells derived from the same passage of cultivation were grown in culture and simultaneously kept on slides. Incubation with medium and different additives (serum, insulin or growth factors) for 12, 24, 48 or 72 hours followed.
The cultivated cells were harvested at the end of the induction. After extraction RNA and proteins were analysed with RT-PCR or western blot. After that gene expression of the cultivated cells was compared to the patient biopsies and to both controls we used. Fetal cardiomyocytes cmc 5097 represented our positive control, HepG2, cells from human hepatocellular carcinoma, were used as negative control. The cells grown on slides were inducted as well and they were processed in immunefluorescence.
We succeeded in cultivating cells deriving from different human myocardial biopsies. Growth of artrial and right or left ventricular cells was equal. The presence of cardiomyocytes was proved by immunehistological expression of specific intracellular structures which represented proteins of the contractile material or the structure of the cells. alpha-sarcomeric actin, F-actin und alpha-actinin were determined with immunefluorescence, gene expression for hANP, hBNP, GATA-4, serca 2, ryanodin 2, phospholamban and NCX (specific for myocytes) was shown with RT-PCR. Additionally we proved the presence of serca 2a with western blot.
Concerning each induction experiment we noticed that we need to add serum for an optimum of cellular growth. If we did not use serum or in case of serum deprivation cellular growth stagnated after two days.
Comparison of untreated biopsies with cultivated and inducted cells showed that hANP, ryanodin 2, NCX and phospholamban were expressed in the untreated biopsies whereas first we could not find an uniform signal in the inducted cells.
If we compared the gene expression of a single factor after various induction times we found that expression of Serca 2, A-Raf, bFGF, VEGF und GATA-4 could be proved after 24 hours of induction. After 48 or 72 hours we could not show any of these genes.
hANP was expressed after two days of induction, hBNP and ryanodin 2 after 72 hours. Gene expression changed with increasing time of induction. Consequently hANP, ryanodin 2 and hBNP represented sensitive markers of hypoxia in our experiments.
We succeeded in establishing a primary cell culture with cardiomyocytes from human myocardiac biopsies.
With our induction experiments we have shown that for an optimum of cellular growth serum (10% FBS), insulin and growth factors (hFGF-B, hEGF) are essential.
After 24 hours of induction gene expression of the cultivated cells in every stress situation was in accordance with gene expression of the untreated biopsies. Therefore the state of myocardiac hypoxia within coronary heart disease could be reproduced in cell culture under these conditions. For this the deprivation of one medium component (serum, insulin or growth factors hFGF-B and hEGF) in culture was sufficient. A 24 hour induction was enough to attain a representative simulation of hypoxia in culture.
We succeeded in examining specifically hypoxic cardiac conditions in cultivated human cardiomyocytes."]},{"key":"dc:format.medium","label":"Dc Format Medium","values":["application/pdf"]},{"key":"dc:title","label":"Title","values":["Etablierung einer Zellkultur aus unterschiedlichen humanen Herzmuskelgeweben sowie die Simulation von verschiedenen Mangelzuständen in vitro","Establishing a primary cell culture of different human heart muscle tissues and simulation of various conditions of deficiency in vitro"]}]}],"canonical_facts":{"dc:contributor":["Holubarsch, Christian J. F."],"dc:creator":["Lehner, Christoph"],"dc:description.abstract":["Ziel meiner Dissertation war es, eine Zellkultur aus unterschiedlichen humanen Herzmuskelgeweben zu etablieren und verschiedene Mangelzustände in vitro zu simulieren.
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Die Zellen in den Flaschen erntete man nach Ende des jeweiligen Induktionsversuches, RNA und Proteine wurden extrahiert und in der RT-PCR bzw. im Western-Blot analysiert.
Anschließend wurde die Genexpression in der Zellkultur mit der in den Patientenproben sowie der der beiden Kontrollen verglichen.
Als Positivkontrolle diente die fötale Kardiomyozyten-Zelllinie cmc 5097. Die Negativkontrolle stellten HepG2-Zellen, Zellen aus menschlichem hepatozellulärem
Karzinom, dar. Die auf den Deckgläschen angezüchteten Zellen wurden ebenfalls induziert und für die Immunfluoreszenz verwandt.
Es gelang, Zellen aus humanen Probebiopsien, die aus verschiedenen Herzregionen stammten, in Kultur zu nehmen und anzuzüchten. Hierbei kam es zu einem Wachstum der Vorhof-, rechts- sowie linksventrikulären Zellen in gleichem Ausmaß.
Der Nachweis des Vorhandenseins von Kardiomyozyten erfolgte durch immunhistochemische Darstellung spezifischer intrazellulärer Strukturen, die Proteine des kontraktilen Materials sowie des Zytoskeletts repräsentierten. In der Immunfluoreszenz wurden selektiv alpha-sarcomeric-Actin, F-Actin und alpha-Actinin nachgewiesen, ferner wurde die Genexpression der myozytenspezifischen Gene hANP, hBNP, GATA-4, Serca 2, Ryanodin 2, Phospholamban und NCX in der RT-PCR bestimmt. Im Western-Blot konnte zusätzlich Serca 2a nachgewiesen werden.
Bei den einzelnen Induktionsversuchen fiel auf, dass für ein optimales Wachstum der Zellen der Zusatz von Serum nötig war. Bei Nichtvorhandensein bzw. Entzug des Serums stagnierte das Zellwachstum bereits nach zwei Tagen.
Der Vergleich unbehandelte Patientenbiopsieanteile zu in Kultur genommene und induzierte Zellen zeigte, dass hANP, Ryanodin 2, NCX und Phospholamban in den unbehandelten Biopsien exprimiert wurden, bei den induzierten Zellen zunächst jedoch kein einheitliches Signal nachgewiesen werden konnte.
Verglich man die Genexpression eines einzelnen Faktors zu verschiedenen Zeitpunkten, erkannte man, dass die Expression von Serca 2, A-Raf, bFGF, VEGF und GATA-4 nach 24 Stunden durchwegs positiv war, nach zwei- bzw. dreitägiger Induktion die Gene jedoch in allen Versuchen nicht mehr dokumentiert werden konnten.
hANP wurde nach 48 Stunden, hBNP und Ryanodin 2 erst nach 72 Stunden exprimiert.
Es konnte mit zunehmender Induktionsdauer eine veränderte Genexpression nachgewiesen werden. hANP, Ryanodin 2 und hBNP stellten somit sensitive Hypoxiemarker in den Versuchen dar.
Somit gelang es, aus entnommenen humanen Myokardbiopsien Primärkulturen mit Kardiomyozyten zu etablieren.
Durch die Induktionsversuche konnte nachgewiesen werden, dass für ein optimales Wachstum der Zellen Serum (10% FBS), Insulin und Wachstumsfaktoren (hFGF-B, hEGF) nötig waren.
Im Zeitintervall nach 24 Stunden entsprachen die Expressionsmuster in den Zellkulturen unter allen Stresssituationen den der unbehandelten Patientenbiopsien. Somit konnte unter diesen Bedingungen der Zustand der myokardialen Hypoxie bei koronarer Herzkrankheit in der Kultur reproduziert werden. Hierzu war bereits der Entzug einer Mediumkomponente – Serum, Insulin oder Wachstumsfaktoren (hFGF-B und hEGF) – in der Kultur ausreichend.
Um eine repräsentative Simulation der Hypoxie in Kultur zu erzielen, reichte eine 24 Stunden-Induktion aus.
Hypoxische Bedingungen am Herzen konnten somit detailiert und abhängig von der gezielten Fragestellung in der Kardiomyozytenkultur untersucht werden.","The aim of my dissertation was to establish a primary cell culture of different human heart muscle tissues and to simulate various conditions of deficiency in vitro.
Ventricular and artrial biopsies were taken from patients during cardiac surgery. One part of these biopsies was directly processed to total-RNA to comprehend gene expression under pathological circumstances. Specific fragments were amplified with RT-PCR and consequently detected by respective primers. Thereupon analysis followed by gel electrophoresis. The other part of myocardiac biopsies was incubated with collagenase and the cells were put in culture. After several passages cells derived from the same passage of cultivation were grown in culture and simultaneously kept on slides. Incubation with medium and different additives (serum, insulin or growth factors) for 12, 24, 48 or 72 hours followed.
The cultivated cells were harvested at the end of the induction. After extraction RNA and proteins were analysed with RT-PCR or western blot. After that gene expression of the cultivated cells was compared to the patient biopsies and to both controls we used. Fetal cardiomyocytes cmc 5097 represented our positive control, HepG2, cells from human hepatocellular carcinoma, were used as negative control. The cells grown on slides were inducted as well and they were processed in immunefluorescence.
We succeeded in cultivating cells deriving from different human myocardial biopsies. Growth of artrial and right or left ventricular cells was equal. The presence of cardiomyocytes was proved by immunehistological expression of specific intracellular structures which represented proteins of the contractile material or the structure of the cells. alpha-sarcomeric actin, F-actin und alpha-actinin were determined with immunefluorescence, gene expression for hANP, hBNP, GATA-4, serca 2, ryanodin 2, phospholamban and NCX (specific for myocytes) was shown with RT-PCR. Additionally we proved the presence of serca 2a with western blot.
Concerning each induction experiment we noticed that we need to add serum for an optimum of cellular growth. If we did not use serum or in case of serum deprivation cellular growth stagnated after two days.
Comparison of untreated biopsies with cultivated and inducted cells showed that hANP, ryanodin 2, NCX and phospholamban were expressed in the untreated biopsies whereas first we could not find an uniform signal in the inducted cells.
If we compared the gene expression of a single factor after various induction times we found that expression of Serca 2, A-Raf, bFGF, VEGF und GATA-4 could be proved after 24 hours of induction. After 48 or 72 hours we could not show any of these genes.
hANP was expressed after two days of induction, hBNP and ryanodin 2 after 72 hours. Gene expression changed with increasing time of induction. Consequently hANP, ryanodin 2 and hBNP represented sensitive markers of hypoxia in our experiments.
We succeeded in establishing a primary cell culture with cardiomyocytes from human myocardiac biopsies.
With our induction experiments we have shown that for an optimum of cellular growth serum (10% FBS), insulin and growth factors (hFGF-B, hEGF) are essential.
After 24 hours of induction gene expression of the cultivated cells in every stress situation was in accordance with gene expression of the untreated biopsies. Therefore the state of myocardiac hypoxia within coronary heart disease could be reproduced in cell culture under these conditions. For this the deprivation of one medium component (serum, insulin or growth factors hFGF-B and hEGF) in culture was sufficient. A 24 hour induction was enough to attain a representative simulation of hypoxia in culture.
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