{"id":{"repo_id":"freiburg-diss","oai_identifier":"oai:freidok.uni-freiburg.de:1280"},"canonical_url":"https://search.dev.ndltd.org/etd/freiburg-diss/oai:freidok.uni-freiburg.de:1280","repository":{"repo_id":"freiburg-diss","name":"University of Freiburg","base_url":"https://freidok.uni-freiburg.de/oai/oai2.php"},"display":{"title":"Modulation der neokortikalen Neurotransmission durch exogene und endogene Cannabinoide unter Berücksichtigung möglicher Speziesunterschiede zwischen Mensch und Tier","abstract":"Das in der Cannabispflanze vorkommende delta9-THC sowie verwandte synthetische Analoga vermitteln ihre pharmakologischen Effekte im Gehirn in erster Linie durch Aktivierung von Cannabinoid CB1 Rezeptoren (CB1-R). Körpereigene Liganden sind die sog. Endocannabinoide (EC), denen man Bedeutung als (patho)-physiologische Neuromodulatoren beimisst. Die Manipulation des \"EC-Systems\" bietet einerseits therapeutische Möglichkeiten, kann aber auch zu unerwünschten Wirkungen auf Kognition und Gedächtnisleistung führen. Auf molekularer Ebene scheinen dabei Effekte auf die Neurotransmission eine wichtige Rolle zu spielen, was allerdings bisher im humanen Gehirn kaum untersucht wurde. In der vorliegenden Arbeit wurden (vor dem Hintergrund möglicher Speziesunterschiede zwischen Mensch und Tier) mittels pharmakologischen und biochemischen in vitro Methoden v.a. funktionelle CB1-R-abhängige und -unabhängige Wirkungen von Cannabinoiden untersucht. Ferner wurde die Rolle von EC als Neuromodulatoren erörtert. Mittels Radioligand-Bindungsstudien wurde die CB1-R-Dichte und die Bindungsaffinität diverser CB1 Liganden in humanem Neokortex- und Amygdalagewebe untersucht. Die elektrisch evozierte [³H]-ACh Freisetzung wurde im Neokortex von Mensch und Maus durch den exogenen CB1-R Agonisten WIN55212-2 gehemmt, wobei im Menschen der Effekt deutlich geringer ausgeprägt war. Zudem kam es nach CB1-R Blockade durch SR141716 (CB1-R Antagonist) nur im Menschen zu einer erhöhten [³H]-ACh Freisetzung. Dies ließ auf einen hohen hemmenden Einfluss endogener CB1-R Agonisten wie Anandamid (AEA) auf die cholinerge Transmission im humanen Neokortex schließen. Das Ausmaß dieses \"EC-Tonus\" scheint dabei von der neuronalen Aktivität abzuhängen. CB1-R-Aktivierung führte bei K+ Stimulation in Gegenwart von TTX zu einem ähnlichen Hemmeffekt wie bei elektrischer Stimulation, sodass CB1-R-Lokalisation auf cholinergen Terminalen im humanen Neokortex angenommen werden kann. Bei der elektrisch und K+ (in Ggw. von TTX) evozierten [³H]-DA Freisetzung im Neokortex wurden ebenfalls deutliche Speziesunterschiede (Mensch - Ratte) beobachtet. Während sich im Menschen die [³H]-DA Freisetzung durch CB1-R-Agonisten und -Antagonisten modulieren ließ, hatten die Substanzen im Neokortex der Ratte keine Wirkung. Es konnte gefolgert werden, dass sich nur im humanen <br>Neokortex durch EC tonisch aktivierte CB1-R auf dopaminergen Terminalen befinden. Um der Vermutung nachzugehen, dass endogene Cannabinoide wie AEA durch neuronale Depolarisation gebildet werden, wurde eine Methode zur Quantifizierung von AEA in Hirngewebe entwickelt. Diese beinhaltete Lipidextraktion, Festphasenextraktion und HPLC-Analyse. Die AEA-Konzentration stieg nach K+ Depolarisation neokortikaler Hirnschnitte von Mensch und Ratte deutlich an. Im Menschen lagen die Konzentrationen signifikant über denen in der Ratte und erreichten Werte, die in etwa im Bereich des gemessenen Bindungs-Ki von AEA lagen. Analog den Superfusionsergebnissen kann also eine größere (patho)-physiologische Bedeutung von ECs im Menschen vermutet werden. CB1-R-unabhängig hemmten Arachidonsäure, AEA und WIN55212-2 den [³H]-5-HT- und [³H]-DA-Uptake im Neokortex der Ratte. Mittels eines ATP-Biolumineszenzassays konnte gezeigt werden, dass die Uptakehemmung durch AEA teilweise durch Hemmung der Na+/K+-ATPase zustande kam. Im Fall von WIN55212-2 konnte eine Beteiligung der Na+/K+-ATPase ausgeschlossen werden, eventuell waren andere ATPasen, \"non-CB1/2\" Rezeptoren oder andere Rezeptorsysteme beteiligt. Die Beeinträchtigung der Na+/K+-ATPase oder anderer ATPasen die an der Aufrechterhaltung des transmembranären Ionengradienten beteiligt sind, könnte einen zytotoxischen Wirkaspekt von Cannabinoiden darstellen. cAMP-Messungen liessen auf die Kopplung von CB1-R an ein inhibitorisches G-Protein im humanen Neokortex schliessen. Die Hemmung der cAMP Bildung durch CB1-R Agonisten und die damit verbundene Aktivierung von auswärtsgleichrichtenden K+ Kanälen könnte dabei zu einem membranpotential-stabilisierenden Effekt führen. Die erhöhte cAMP Bildung nach CB1-R-Blockade lässt sich mit der Antagonisierung der EC-Aktivität erklären. Die verringerte cholinerge und dopaminerge Neurotransmission durch CB1-R-Aktivierung im humanen Neokortex mag zu den negativen Auswirkungen von Cannabis auf Kognition und Gedächtnisleistung beitragen. Das EC-System scheint vor allem im menschlichen Gehirn tonisch aktiv zu sein, eine regulatorische Rolle bei Gedächtnisprozessen ist denkbar. Die Ergebnisse dieser Arbeit lassen andererseits auch vermuten, dass die Blockade des EC-Tonus mittels CB1-R-Antagonisten eine <br>Therapieoption bei Demenzerkrankungen, wie beispielsweise dem Morbus Alzheimer, bietet. Die beschriebenen Speziesunterschiede machen die Problematik deutlich, Daten aus Tiermodellen direkt auf den Menschen zu übertragen. Somit sollten auch künftig tierexperimentelle Studien möglichst mit Experimenten an humanem Gewebe kombiniert werden.","abstract_html":"Das in der Cannabispflanze vorkommende delta9-THC sowie verwandte synthetische Analoga vermitteln ihre pharmakologischen Effekte im Gehirn in erster Linie durch Aktivierung von Cannabinoid CB1 Rezeptoren (CB1-R). Körpereigene Liganden sind die sog. Endocannabinoide (EC), denen man Bedeutung als (patho)-physiologische Neuromodulatoren beimisst. Die Manipulation des &quot;EC-Systems&quot; bietet einerseits therapeutische Möglichkeiten, kann aber auch zu unerwünschten Wirkungen auf Kognition und Gedächtnisleistung führen. Auf molekularer Ebene scheinen dabei Effekte auf die Neurotransmission eine wichtige Rolle zu spielen, was allerdings bisher im humanen Gehirn kaum untersucht wurde. 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Somit sollten auch künftig tierexperimentelle Studien möglichst mit Experimenten an humanem Gewebe kombiniert werden.","Delta9-THC, natural compound of the Cannabis plant, and related synthetic substances mediate their pharmacological effects in brain mainly through activation of cannabinoid CB1 receptors (CB1-r). Endogenous ligands are the so-called endocannabinoids which are supposed to act as (patho)-physiological neuromodulators. Manipulation of the ‘endocannbinoid-system’ offers therapeutic possibilities on the one hand, but may also lead to undesired effects on e.g. cognition and memory. One a molecular level, effects on neurotransmissions seem to play an important role, however, this is hardly explored in human brain so far. Against the background of possible species differences between humans and animals, the present work mainly investigates functional CB1-r-dependent and -independent effects of cannabinoids using pharmacological and biochemical in vitro methods. Furthermore, a possible neuromodulatory role of endocannabinoids is discussed. • Radioligand binding studies were performed in order to determine CB1-r density and binding affinity of various CB1-r ligands in human neocotical and amygdala tissue. • Electrically evoked [³H]-ACh release was inhibited by the exogenous CB1-r agonist WIN55212-2 in neocortex of humans and mice. However, the extent of inhibition was considerably smaller in humans. Furthermore, CB1-r blockade by the CB1-r antagonist SR141716 led to an increase in [³H]-ACh release only in human neocortex, suggesting a massive inhibitory impact of endogenous CB1-r agonists like anandamide (AEA) on cholinergic transmissions in human neocortex. The extent of such an ‘ec-tone’ seems to depend on neuronal activity. • When stimulated chemically (high K+, presence of TTX), CB1-r activation in human neocortex led to an inhibition of [³H]-ACh release that was similar to the conditions when release was evoked electrically. Thus it can be assumed, that CB1-r are located on cholinergic nerve terminals in human neocortex. • Electrically and K+ (presence of TTX) evoked neocortical [³H]-DA release also revealed marked species differences between humans and rats. While [³H]-DA release was modulated by CB1-r agonists and antagonists in humans, these compounds failed to affect [³H]-DA release in the rat. This suggests, that only in the human neocortex CB1-r, which seem to be tonically activated by endocannabinoids, are located on dopaminergic nerve terminals. <br>• In order to find out, whether endogenous cannabinoids like AEA are synthesized upon neuronal depolarisation, a simple method for the quantification of AEA in brain tissue was developed. This included lipd extraction, solid phase separation and HPLC analysis. AEA levels were increased after K+ depolarisation of human and rat neocortical slices. In humans, absolute AEA levels were found to be significantly higher that in the rat, yielding values that were in the range of the binding Ki of AEA. This suggests, corresponding to the results of the superfusion studies, that endocannabinoids may have a greater (patho)-physiological relevance in humans. • In rat neocortex, [³H]-5-HT- and [³H]-DA-uptake were inhibited by arachidonic acid, AEA and WIN55212-2 in a CB1-r-independent manner. Utilizing an ATP-bioluminescence-assay it was shown, that uptake-inhibition by AEA was mediated by inhibition of Na+/K+-ATPase. With respect to WIN55212-2, an involvement of Na+/K+-ATPase could be ruled out. Instead, participation of other ATPases, ‚non-CB1/2‘ receptors or other receptor systems is possible. Impaired activity of Na+/K+-ATPase or other ATPases that maintain ion gradients over the membrane may thus contribute to a possible cytotoxic effect of cannabinoids. • The results of the cAMP assays suggested the coupling of CB1-r to an inhibitory G-protein in human neocortex. Inhibition of cAMP accumulation by CB1-r agonists with subsequent activation of outward rectifying K+ channels may lead to stabilisation of membrane potential. Increased cAMP accumulation after CB1-r blockade is likely due to antagonism of endocannabinoid activity. Reduced cholinergic and dopaminergic neurotransmissions following CB1-r activation in human neocortex may contribute to the negative effect of Cannabis on cognition and memory. The endocannabinoid-system seems to be tonically active particularly in human brain, a regulatory role on memory processes might be possible. The results of the present work furthermore suggest, that blockade of tonical endocannabinoid activity by CB1-r antagonists offers a new therapeutic option on, e.g., Alzheimers disease. The described species differences reveal the difficulty of transferring dates from animal models to biological conditions in humans. 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Die elektrisch evozierte [³H]-ACh Freisetzung wurde im Neokortex von Mensch und Maus durch den exogenen CB1-R Agonisten WIN55212-2 gehemmt, wobei im Menschen der Effekt deutlich geringer ausgeprägt war. Zudem kam es nach CB1-R Blockade durch SR141716 (CB1-R Antagonist) nur im Menschen zu einer erhöhten [³H]-ACh Freisetzung. Dies ließ auf einen hohen hemmenden Einfluss endogener CB1-R Agonisten wie Anandamid (AEA) auf die cholinerge Transmission im humanen Neokortex schließen. Das Ausmaß dieses \"EC-Tonus\" scheint dabei von der neuronalen Aktivität abzuhängen. CB1-R-Aktivierung führte bei K+ Stimulation in Gegenwart von TTX zu einem ähnlichen Hemmeffekt wie bei elektrischer Stimulation, sodass CB1-R-Lokalisation auf cholinergen Terminalen im humanen Neokortex angenommen werden kann. Bei der elektrisch und K+ (in Ggw. von TTX) evozierten [³H]-DA Freisetzung im Neokortex wurden ebenfalls deutliche Speziesunterschiede (Mensch - Ratte) beobachtet. Während sich im Menschen die [³H]-DA Freisetzung durch CB1-R-Agonisten und -Antagonisten modulieren ließ, hatten die Substanzen im Neokortex der Ratte keine Wirkung. Es konnte gefolgert werden, dass sich nur im humanen <br>Neokortex durch EC tonisch aktivierte CB1-R auf dopaminergen Terminalen befinden. Um der Vermutung nachzugehen, dass endogene Cannabinoide wie AEA durch neuronale Depolarisation gebildet werden, wurde eine Methode zur Quantifizierung von AEA in Hirngewebe entwickelt. Diese beinhaltete Lipidextraktion, Festphasenextraktion und HPLC-Analyse. Die AEA-Konzentration stieg nach K+ Depolarisation neokortikaler Hirnschnitte von Mensch und Ratte deutlich an. Im Menschen lagen die Konzentrationen signifikant über denen in der Ratte und erreichten Werte, die in etwa im Bereich des gemessenen Bindungs-Ki von AEA lagen. Analog den Superfusionsergebnissen kann also eine größere (patho)-physiologische Bedeutung von ECs im Menschen vermutet werden. CB1-R-unabhängig hemmten Arachidonsäure, AEA und WIN55212-2 den [³H]-5-HT- und [³H]-DA-Uptake im Neokortex der Ratte. Mittels eines ATP-Biolumineszenzassays konnte gezeigt werden, dass die Uptakehemmung durch AEA teilweise durch Hemmung der Na+/K+-ATPase zustande kam. Im Fall von WIN55212-2 konnte eine Beteiligung der Na+/K+-ATPase ausgeschlossen werden, eventuell waren andere ATPasen, \"non-CB1/2\" Rezeptoren oder andere Rezeptorsysteme beteiligt. Die Beeinträchtigung der Na+/K+-ATPase oder anderer ATPasen die an der Aufrechterhaltung des transmembranären Ionengradienten beteiligt sind, könnte einen zytotoxischen Wirkaspekt von Cannabinoiden darstellen. cAMP-Messungen liessen auf die Kopplung von CB1-R an ein inhibitorisches G-Protein im humanen Neokortex schliessen. Die Hemmung der cAMP Bildung durch CB1-R Agonisten und die damit verbundene Aktivierung von auswärtsgleichrichtenden K+ Kanälen könnte dabei zu einem membranpotential-stabilisierenden Effekt führen. 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Furthermore, a possible neuromodulatory role of endocannabinoids is discussed. • Radioligand binding studies were performed in order to determine CB1-r density and binding affinity of various CB1-r ligands in human neocotical and amygdala tissue. • Electrically evoked [³H]-ACh release was inhibited by the exogenous CB1-r agonist WIN55212-2 in neocortex of humans and mice. However, the extent of inhibition was considerably smaller in humans. Furthermore, CB1-r blockade by the CB1-r antagonist SR141716 led to an increase in [³H]-ACh release only in human neocortex, suggesting a massive inhibitory impact of endogenous CB1-r agonists like anandamide (AEA) on cholinergic transmissions in human neocortex. The extent of such an ‘ec-tone’ seems to depend on neuronal activity. • When stimulated chemically (high K+, presence of TTX), CB1-r activation in human neocortex led to an inhibition of [³H]-ACh release that was similar to the conditions when release was evoked electrically. Thus it can be assumed, that CB1-r are located on cholinergic nerve terminals in human neocortex. • Electrically and K+ (presence of TTX) evoked neocortical [³H]-DA release also revealed marked species differences between humans and rats. While [³H]-DA release was modulated by CB1-r agonists and antagonists in humans, these compounds failed to affect [³H]-DA release in the rat. This suggests, that only in the human neocortex CB1-r, which seem to be tonically activated by endocannabinoids, are located on dopaminergic nerve terminals. <br>• In order to find out, whether endogenous cannabinoids like AEA are synthesized upon neuronal depolarisation, a simple method for the quantification of AEA in brain tissue was developed. This included lipd extraction, solid phase separation and HPLC analysis. AEA levels were increased after K+ depolarisation of human and rat neocortical slices. 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