Herstellung und Charakterisierung von unsymmetrischen Liposomen unter Verwendung von rekombinanten Proteinen
Die vorliegende Arbeit beschäftigte sich mit der Herstellung und Charakterisierung von Liposomen, die eine unsymmetrische Lipidverteilung zwischen dem inneren und äusseren Monolayer aufweisen. Liposomen werden aufgrund ihrer strukturellen Ähnlichkeit mit zellulären Membranen in der Forschung häufig als Biomembran-Modelle herangezogen, um verschiedenste Vorgänge, die in und an Membranen stattfinden, isoliert zu untersuchen. Die dafür eingesetzten Liposomen müssen verschiedene Anforderungen erfüllen, um der sehr komplexen Situation an zellulären Membranen in Ansätzen Rechnung zu tragen. Viele natürliche Membranen zeigen eine unsymmetrische Verteilung verschiedener Lipide zwischen den beiden Monolayern. Bekanntestes Beispiel ist die humane Erythrozytenmembran, bei der sich die Aminophospholipide Phosphatidylserin (PS) und Phosphatidylethanolamin (PE) hauptsächlich im inneren Monolayer aufhalten, während die cholinhaltigen Lipide Phosphatidylcholin (PC) und Sphingomyelin mehr im äusseren Monolayer zu finden sind. Die Unsymmetrie sollte unter Verwendung von rekombinant aus E. coli gewonnenen Proteinen erzeugt werden. Dabei wurden zwei verschiedene Methoden angewandt: der Lipidaustausch zwischen zwei Liposomenpopulationen und die enzymatische Modifizierung der Liposomenoberfläche. Der Lipidaustausch zwischen sogenannten Donorliposomen (90 mol% PC, 10 mol% PS bzw. Phosphatidylglycerol, PG) und Akzeptorliposomen (100 mol% PC), der normalerweise sehr langsam stattfindet (t½ = mehrere Tage) konnte unter Verwendung des rekombinant in E. coli gewonnenen nichtspezifischen Lipidtransfer-proteins (ns-LTP) aus der Rattenleber um ein Vielfaches beschleunigt werden. Liposomen, die in ihrem Inneren ein im Bilayer verankertes zweidimensionales Polymernetzwerk (künstliches Zytoskelett) enthalten, wiesen im Vergleich zu normalen Liposomen einen deutlich schnelleren spontanen und auch protein-vermittelten Lipidaustausch auf. Eine nachfolgende Trennung der beiden Liposomenpopulationen gelang über die Free Flow Elektrophorese (FFE). Bei der FFE handelt es sich um eine trägerfreie Elektrophorese, bei der Proben in einem laminaren Pufferstrom aufgetrennt und in 96 Fraktionen gesammelt werden, wodurch sie für nachfolgende Untersuchungen weiter zur Verfügung stehen. So wurde unter anderem die transversale Diffusion von PG und PS (Flipp-Flopp) über Zetapotentialmessungen und die Fluoreszenzsonde 2-(p-Toluidinyl)naphthalen-6-sulfonsäure (TNS) bestimmt. Die Halbwertszeiten des PG-Flipp-Flopp lagen bei 10 bis 20 h, die des PS-Flipp-Flopp bei etwa 3,5 h. Zur enzymatischen Modifizierung der Liposomenoberfläche wurde die E. coli Phosphatidylserin-Decarboxylase (PSD) als Fusionsprotein mit der Glutathion-S-Transferase in E. coli hergestellt. Das Enzym beschleunigt die Umwandlung von PS zu PE. Aufgrund seiner Grösse vermag es liposomale Membranen nicht zu durch-dringen, wodurch nur im äusseren Monolayer vorliegendes PS modifiziert wird. Dadurch wird bezüglich PS und PE eine Unsymmetrie zwischen den beiden Monolayern generiert.
Lipidunsymmetrie, Free Flow Elektrophorese, Lipidtransferprotein, Flipp Flopp, vesicles, free flow electrophoresis, sterol carrier protein 2, transbilayer distribution, flip-flop
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