Autotrophe CO2-Fixierung in thermophilen Mikroorganismen

Derzeit sind bei Mikroorganismen vier verschiedene Stoffwechselwege zur autotrophen CO2-Fixierung bekannt. Dies sind der Calvin-Zyklus, der reduktive Citrat-Zyklus, der reduktive Acetyl-CoA-Weg und der 3-Hydroxypropionat-Zyklus. Letzterer wurde bisher nur im phototrophen Bakterium Chloroflexus aurantiacus nachgewiesen. <br>In den letzten Jahren wurden zahlreiche thermophile und hyperthermophile Vertreter der Crenarchaeota isoliert, die autotroph wachsen können. Es gibt sehr wenige Unter-suchungen zur autotrophen CO2-Fixierung in dieser großen Organismengruppe. Erste Arbeiten deuten auf einen 3-Hydroxypropionat-Zyklus in Vertretern der Familie der Sulfolobaceae hin. <br>In dieser Arbeit sollte der 3-Hydroxypropionat-Zyklus sowohl in C. aurantiacus, als auch in Metallosphaera sedula, einem Mitglied der Sulfolobaceae, näher untersucht werden. Außerdem wurde die Art der jeweiligen CO2-Fixierung in verschiedenen Vertretern der Crenarchaeota untersucht. <br>Folgende Ergebnisse wurden erzielt: <br>1. Die Malonyl-CoA-Reduktase, ein charakteristisches Enzym des 3-Hydroxypropionat-Zyklus, wurde aus C. aurantiacus gereinigt und charakterisiert. Das entsprechende Gen wurde kloniert und sequenziert. Die Malonyl-CoA-Reduktase katalysiert die NADPH-abhängige, zweistufige Reduktion von Malonyl-CoA über Malonatsemialdehyd zu 3-Hydroxypropionat. Da die Malonyl-CoA-Reduktase in keinem anderen Stoffwechselweg benötigt wird, kann sie als Schlüsselenzym des 3-Hydroxypropionat-Zyklus angesehen werden. <br>2. Es wurden in autotrophen Vertretern aller Familien der Crenarchaeota die Schlüssel-enzymaktivitäten der bekannten CO2-Fixierungswege untersucht. Bei Pyrodictium abyssi und Pyrodictium occultum (Pyrodictiaceae) wurde eine Ribulose-1,5-bisphosphat-Carboxylase-Aktivität nachgewiesen. Es wird ein modifizierter Calvin-Zyklus vermutet. In Ignicoccus islandicus und Ignicoccus pacificus (Desulfurococcaceae) konnte nur die Pyruvat:Akzeptor-Oxidoreduktase als Enzym eines bekannten CO2-Fixierungswegs nachgewiesen werden. Die Ergebnisse sprechen für einen neuartigen, bisher unbekannten CO2-Fixierungsweg in dieser Familie. In den Vertretern der Sulfolobaceae, Acidianus ambivalens, M. sedula und Sulfolobus sp. VE 6, konnten Aktivitäten der Schlüsselenzyme des 3-Hydroxypropionat-Zyklus nachgewiesen werden. Zusätzlich konnte in M. sedula und Sulfolobus sp. VE 6 auch die Aktivitäten der ?-Ketoglutarat:Akzeptor-Oxidoreduktase gemessen werden. Die Sulfolobaceae haben demnach vermutlich einen modifizierten 3-Hydroxypropionat-Zyklus. Bei Pyrobaculum islandicum (Thermoproteaceae) wurden nur die Schlüsselenzyme des reduktiven Citrat-Zyklus gefunden, der hier vermutlich als autotropher CO2-Fixierungsweg dient. <br>3. Die Ribulose-1,5-bisphosphat-Carboxylase-Aktivität in Pd. abyssi und Pd. occultum wurde näher charakterisiert. Über HPLC-Analyse konnte 3-Phosphoglycerat als primäres CO2-Fixierungsprodukt nachgewiesen werden. Das Enzym war noch in kochendem Wasser aktiv und scheint, wie die anderen RubisCO-Proteine der Archaea, ein Enzym der Form III zu sein. <br>4. Der 3-Hydroxypropionat-Zyklus in M. sedula wurde näher charakterisiert, indem die Regulation von Enzymen des zentralen Kohlenstoff-Stoffwechsels untersucht wurde. Die Aktivitäten wichtiger Enzyme des 3-Hydroxypropionat-Zyklus waren unter autotrophen Wachstumsbedingungen hochreguliert, ebenso die ?-Ketoglutarat:Akzeptor-Oxidoreduktase und die Pyruvat:Akzeptor-Oxidoreduktase. Die Enzyme des Citrat-Zyklus waren dagegen unter heterotrophen Wachstumsbedingungen hochreguliert. <br>5. Um eine eventuelle Beteiligung der ?-Ketoglutarat:Akzeptor-Oxidoreduktase an der autotrophen CO2-Fixierung in M. sedula zu überprüfen, wurden 13C-Markierungsexperimente in M. sedula durchgeführt. Autotroph wachsende Zellen wurden mit 13C-Succinat gefüttert und das 13C-Markierungsmuster der isolierten Aminosäuren analysiert. Die Ergebnisse zeigen, dass eine Beteiligung der ?-Ketoglutarat:Akzeptor-Oxidoreduktase an der autotrophen CO2-Fixierung ausgeschlossen ist. Gleichzeitig unterstützte der Vergleich der 13C-Makierungsmuster von M. sedula und C. aurantiacus die These eines alternativen Wegs der Acetyl-CoA-Regeneration. <br>6. Die Acetyl-CoA-/Propionyl-CoA-Carboxylase, das CO2-fixierende Enzym des 3-Hydroxypropionat-Zyklus, wurde aus M. sedula gereinigt und charakterisiert. Sie ist aus 3 Untereinheiten (Biotincarboxylase AccB, Biotin-Carrier-Protein AccC, Carboxyltransferase PccB) aufgebaut und katalysiert beide Carboxylierungsreaktionen mit der gleichen Rate. Im Gegensatz zu den Carboxylasen der meisten anderen Organismen ist das Enzym aus M. sedula stabil und konnte als Holoenzym gereinigt werden. Wahrscheinlich hat es eine (AccB, AccC, PccB)4-Struktur. Das Enzym aus M. sedula wäre ein ideales Objekt für die Kristallisation und Röntgenstrukturanalyse dieses wichtigen Enzyms. Es konnte bestätigt werden, dass die vermuteten Gensequenzen von M. sedula für diese Carboxylase codieren.

Author dc:creator

• Hügler, Michael

Contributors dc:contributor

• Fuchs, Georg

• 3-Hydroxypropionat-Zyklus
• CO2 fixation
• Archaea
• autotrophic
• thermophilic
• 3-hydroxypropionate cycle

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