{"id":{"repo_id":"freiburg-diss","oai_identifier":"oai:freidok.uni-freiburg.de:1110"},"canonical_url":"https://search.dev.ndltd.org/etd/freiburg-diss/oai:freidok.uni-freiburg.de:1110","repository":{"repo_id":"freiburg-diss","name":"University of Freiburg","base_url":"https://freidok.uni-freiburg.de/oai/oai2.php"},"display":{"title":"Entwicklung einer nicht-viralen upscalebaren Formulierung zur Transfektion humaner vaskulärer Endothelzellen und glatter Muskelzellen","abstract":"Das Ziel dieser Arbeit war es, eine Formulierung auf der Basis von Lipiden oder Polymeren zu entwi-ckeln, die humane vaskuläre Endothelzellen und glatte Muskelzellen mit hoher Effizienz transfizieren kann und GMP-gerecht und upscalebar herstellbar ist.
Zur gentherapeutischen Behandlung der Arteriosklerose ist es nötig, einen Ersatz für virale Carrier-systeme zu finden, da diese zwar effektiv, aber immunogen bzw. krebsbildend wirken können. Diese nicht-viralen Systeme dürfen den viralen in ihrer Effizienz nicht nachstehen, aber sollten weniger to-xisch, nicht immunogen und einfacher und im großen Maßstab herstellbar sein.
Dazu wurden Zellmodelle aus humanen Aortaendothelzellen (HAEC), humanen glatten Aortamuskel-zellen (HASMC) und einer Rattenzelllinie (A-10 SMC) als Kontrollzelllinie sowie eine Methode zur quantitativen Bestimmung von GFP mittels Durchflusszytometrie als Transfektionsnachweis etabliert. In Screeningversuchen wurden die kommerziell erhältlichen nicht-viralen Systeme Superfect®, FuGe-ne 6®, Effectene®, LipofectAmine Plus®, Lipofectin®, DC-30® und DAC-30® mit den drei Zellarten in Gegenwart von Serum getestet und Einflussfaktoren auf die Transfektionseffizienz untersucht. Zusätz-lich wurden Abhängigkeiten der Transfektion von der Zellart, Passagezahl der Zellen, Aggregatgröße, der Mischreihenfolge von Transfektionsreagens und DNA und der Ladungsverhältnisse der Aggregate untersucht. FuGene 6®, Superfect®, DC-30® und DAC-30® stellten sich als die besten Transfektions-reagenzien für glatte Aortamuskelzellen des Menschen (HASMC) und der Ratte (A-10 SMC) heraus. Weitere untersuchte Transfektionsreagenzien, wie Lipofectin®, LipofectAmine Plus® und Effectene®, erreichten geringe Transfektionseffizienzen bei HASMC und A-10 SMC. Humane Aortaendothelzellen wurden bisher als schwer zu transfizierende Zellen beschrieben. Die Untersuchungen in dieser Arbeit konnten zeigen, dass Superfect® und DAC-30® zu einer erfolgreichen Transfektion von HAEC führten. Weitere liposomale Transfektionsreagenzien, wie DC-30® und Lipofectin®, zeigten nur eine sehr ge-ringe Transfektion von HAEC. Auch Systeme, die aus einer Kombination von Lipiden und DNA-kondensierenden Reagenzien bestehen, wie Effectene® und LipofectAmine Plus®, transfizierten nur vereinzelte HAEC. Keinerlei Transfektion wurde mit FuGene 6® erreicht. Im Hinblick auf eine GMP-gerechte Herstellung in upscalebarem Rahmen sind von den untersuchten Reagenzien die beiden Lipide DC-30® und DAC-30® als am besten geeignet einzustufen.
Zur Produktion von in vivo einsetzbaren, stabilen Formulierungen wurde im Rahmen dieser Arbeit eine Herstelltechnik entwickelt, die zu physikalisch stabilen Lipoplexen führt. Bei diesem Verfahren handelt es sich um ein kontinuierliches Mischen von DNA und Lipid mit Hilfe einer Schlauchpumpe und eines Y-Stücks mit anschließender Lyophilisation der Lipoplexe. Die DNA und das Lipid werden mit einem konstanten Verhältnis und konstanter Geschwindigkeit zusammengepumpt, wodurch der Einfluss der Mischreihenfolge ausgeschlossen werden kann. Zusätzlich werden extrudierte Liposomen eingesetzt, so dass von einer homogenen Liposomengröße ausgegangen werden kann. Diese Methode ist ein-fach und upscalebar, da durch den kontinuierlichen Prozess Formulierungen mit Volumina bis in den Litermaßstab hergestellt werden können. Nach diesem Verfahren hergestellte Lipoplexe aus DC-30® und DAC-30® und einem GFP-exprimierenden Plasmid erreichten vergleichbare Transfektionseffizien-zen bei HASMC und A-10 SMC wie herkömmlich im kleinen Maßstab im Mikroreaktionsgefäß herge-stellte Lipoplexe. Nur die im Mikroreaktionsgefäß erzielte Transfektionseffizienz von HAEC konnte mit diesen Lipoplexen nicht erreicht werden. Zur Optimierung des Herstellverfahrens wurden mehrere Parameter (Transfektionsmedium, Extrusion des Lipids, Y-Stück-Größe) variiert und der Einfluss auf die Transfektionseffizienz und Größe der Lipoplexe untersucht. Nach Redispergieren von lyophilisier-ten Lipoplexen konnte eine Reproduzierbarkeit der Lipoplexgröße von Vial zu Vial und von Charge zu Charge nachgewiesen werden. Dieses Verfahren wurde erfolgreich auf ein therapeutisch wirksames Plasmid übertragen.
Zur Verbesserung der Qualitätskontrolle von Lipidmischungen konnte ein neues Verfahren zur gleich-zeitigen Analyse von Cholesterolderivaten (anhand von DC-Chol und DAC-Chol) und Phospholipiden (am Beispiel von DOPE) entwickelt werden. Mittels der Kombination aus Dünnschichtchromatographie und einer Detektion über Flammenionisation konnten quantitative Lipidanalysen durchgeführt werden, die eine relative Standardabweichung zwischen 1 bis 6% aufwiesen. Es konnte eine kalibrierbare und reproduzierbare Methode zur Lipidanalytik entwickelt werden, die die quantitative Analyse von DC-30® und DAC-30® ermöglicht.","abstract_html":"Das Ziel dieser Arbeit war es, eine Formulierung auf der Basis von Lipiden oder Polymeren zu entwi-ckeln, die humane vaskuläre Endothelzellen und glatte Muskelzellen mit hoher Effizienz transfizieren kann und GMP-gerecht und upscalebar herstellbar ist. <br>Zur gentherapeutischen Behandlung der Arteriosklerose ist es nötig, einen Ersatz für virale Carrier-systeme zu finden, da diese zwar effektiv, aber immunogen bzw. krebsbildend wirken können. Diese nicht-viralen Systeme dürfen den viralen in ihrer Effizienz nicht nachstehen, aber sollten weniger to-xisch, nicht immunogen und einfacher und im großen Maßstab herstellbar sein. <br>Dazu wurden Zellmodelle aus humanen Aortaendothelzellen (HAEC), humanen glatten Aortamuskel-zellen (HASMC) und einer Rattenzelllinie (A-10 SMC) als Kontrollzelllinie sowie eine Methode zur quantitativen Bestimmung von GFP mittels Durchflusszytometrie als Transfektionsnachweis etabliert. In Screeningversuchen wurden die kommerziell erhältlichen nicht-viralen Systeme Superfect®, FuGe-ne 6®, Effectene®, LipofectAmine Plus®, Lipofectin®, DC-30® und DAC-30® mit den drei Zellarten in Gegenwart von Serum getestet und Einflussfaktoren auf die Transfektionseffizienz untersucht. Zusätz-lich wurden Abhängigkeiten der Transfektion von der Zellart, Passagezahl der Zellen, Aggregatgröße, der Mischreihenfolge von Transfektionsreagens und DNA und der Ladungsverhältnisse der Aggregate untersucht. FuGene 6®, Superfect®, DC-30® und DAC-30® stellten sich als die besten Transfektions-reagenzien für glatte Aortamuskelzellen des Menschen (HASMC) und der Ratte (A-10 SMC) heraus. Weitere untersuchte Transfektionsreagenzien, wie Lipofectin®, LipofectAmine Plus® und Effectene®, erreichten geringe Transfektionseffizienzen bei HASMC und A-10 SMC. Humane Aortaendothelzellen wurden bisher als schwer zu transfizierende Zellen beschrieben. Die Untersuchungen in dieser Arbeit konnten zeigen, dass Superfect® und DAC-30® zu einer erfolgreichen Transfektion von HAEC führten. Weitere liposomale Transfektionsreagenzien, wie DC-30® und Lipofectin®, zeigten nur eine sehr ge-ringe Transfektion von HAEC. Auch Systeme, die aus einer Kombination von Lipiden und DNA-kondensierenden Reagenzien bestehen, wie Effectene® und LipofectAmine Plus®, transfizierten nur vereinzelte HAEC. Keinerlei Transfektion wurde mit FuGene 6® erreicht. Im Hinblick auf eine GMP-gerechte Herstellung in upscalebarem Rahmen sind von den untersuchten Reagenzien die beiden Lipide DC-30® und DAC-30® als am besten geeignet einzustufen. <br>Zur Produktion von in vivo einsetzbaren, stabilen Formulierungen wurde im Rahmen dieser Arbeit eine Herstelltechnik entwickelt, die zu physikalisch stabilen Lipoplexen führt. Bei diesem Verfahren handelt es sich um ein kontinuierliches Mischen von DNA und Lipid mit Hilfe einer Schlauchpumpe und eines Y-Stücks mit anschließender Lyophilisation der Lipoplexe. Die DNA und das Lipid werden mit einem konstanten Verhältnis und konstanter Geschwindigkeit zusammengepumpt, wodurch der Einfluss der Mischreihenfolge ausgeschlossen werden kann. Zusätzlich werden extrudierte Liposomen eingesetzt, so dass von einer homogenen Liposomengröße ausgegangen werden kann. Diese Methode ist ein-fach und upscalebar, da durch den kontinuierlichen Prozess Formulierungen mit Volumina bis in den Litermaßstab hergestellt werden können. Nach diesem Verfahren hergestellte Lipoplexe aus DC-30® und DAC-30® und einem GFP-exprimierenden Plasmid erreichten vergleichbare Transfektionseffizien-zen bei HASMC und A-10 SMC wie herkömmlich im kleinen Maßstab im Mikroreaktionsgefäß herge-stellte Lipoplexe. Nur die im Mikroreaktionsgefäß erzielte Transfektionseffizienz von HAEC konnte mit diesen Lipoplexen nicht erreicht werden. Zur Optimierung des Herstellverfahrens wurden mehrere Parameter (Transfektionsmedium, Extrusion des Lipids, Y-Stück-Größe) variiert und der Einfluss auf die Transfektionseffizienz und Größe der Lipoplexe untersucht. Nach Redispergieren von lyophilisier-ten Lipoplexen konnte eine Reproduzierbarkeit der Lipoplexgröße von Vial zu Vial und von Charge zu Charge nachgewiesen werden. Dieses Verfahren wurde erfolgreich auf ein therapeutisch wirksames Plasmid übertragen. <br>Zur Verbesserung der Qualitätskontrolle von Lipidmischungen konnte ein neues Verfahren zur gleich-zeitigen Analyse von Cholesterolderivaten (anhand von DC-Chol und DAC-Chol) und Phospholipiden (am Beispiel von DOPE) entwickelt werden. Mittels der Kombination aus Dünnschichtchromatographie und einer Detektion über Flammenionisation konnten quantitative Lipidanalysen durchgeführt werden, die eine relative Standardabweichung zwischen 1 bis 6% aufwiesen. Es konnte eine kalibrierbare und reproduzierbare Methode zur Lipidanalytik entwickelt werden, die die quantitative Analyse von DC-30® und DAC-30® ermöglicht.","abstract_has_math":false,"creators":["Kiefer, Karin"],"institution":null,"degree_name":null,"degree_level":null,"degree_discipline":null,"degree_department":null,"school":null,"contributors":["Peschka-Süss, Regine"],"advisors":[],"committee_chairs":[],"committee_members":[],"year":null,"date_issued":"","date_published":null,"updated_at":"2026-07-24T02:22:03Z","subjects":["humane vaskuläre Endothelzellen","humane glatte Muskelzellen","nicht-viraler Gentransfer","upscalebar","transfection efficiency","non-viral gene transfer","human endothelial cells","human smooth muscle cells","upscale"],"languages":[],"rights":[],"rights_urls":[],"identifier_entries":[]},"links":{"outbound_url":"https://freidok.uni-freiburg.de/data/1110","outbound_label":"Repository record","outbound_source":"source_url"},"metadata_groups":[{"id":"people","label":"People","entries":[{"key":"dc:contributor","label":"Contributor","values":["Peschka-Süss, Regine"]},{"key":"dc:creator","label":"Author","values":["Kiefer, Karin"]}]},{"id":"academic_context","label":"Academic Context","entries":[{"key":"dc:type","label":"Dc Type","values":["DoctoralThesis"]}]},{"id":"subjects_keywords","label":"Subjects and Keywords","entries":[{"key":"dc:subject","label":"Dc Subject","values":["humane vaskuläre Endothelzellen","humane glatte Muskelzellen","nicht-viraler Gentransfer","upscalebar","transfection efficiency","non-viral gene transfer","human endothelial cells","human smooth muscle cells","upscale"]}]},{"id":"additional","label":"Additional Metadata","entries":[{"key":"dc:description.abstract","label":"Abstract","values":["Das Ziel dieser Arbeit war es, eine Formulierung auf der Basis von Lipiden oder Polymeren zu entwi-ckeln, die humane vaskuläre Endothelzellen und glatte Muskelzellen mit hoher Effizienz transfizieren kann und GMP-gerecht und upscalebar herstellbar ist.
Zur gentherapeutischen Behandlung der Arteriosklerose ist es nötig, einen Ersatz für virale Carrier-systeme zu finden, da diese zwar effektiv, aber immunogen bzw. krebsbildend wirken können. Diese nicht-viralen Systeme dürfen den viralen in ihrer Effizienz nicht nachstehen, aber sollten weniger to-xisch, nicht immunogen und einfacher und im großen Maßstab herstellbar sein.
Dazu wurden Zellmodelle aus humanen Aortaendothelzellen (HAEC), humanen glatten Aortamuskel-zellen (HASMC) und einer Rattenzelllinie (A-10 SMC) als Kontrollzelllinie sowie eine Methode zur quantitativen Bestimmung von GFP mittels Durchflusszytometrie als Transfektionsnachweis etabliert. In Screeningversuchen wurden die kommerziell erhältlichen nicht-viralen Systeme Superfect®, FuGe-ne 6®, Effectene®, LipofectAmine Plus®, Lipofectin®, DC-30® und DAC-30® mit den drei Zellarten in Gegenwart von Serum getestet und Einflussfaktoren auf die Transfektionseffizienz untersucht. Zusätz-lich wurden Abhängigkeiten der Transfektion von der Zellart, Passagezahl der Zellen, Aggregatgröße, der Mischreihenfolge von Transfektionsreagens und DNA und der Ladungsverhältnisse der Aggregate untersucht. FuGene 6®, Superfect®, DC-30® und DAC-30® stellten sich als die besten Transfektions-reagenzien für glatte Aortamuskelzellen des Menschen (HASMC) und der Ratte (A-10 SMC) heraus. Weitere untersuchte Transfektionsreagenzien, wie Lipofectin®, LipofectAmine Plus® und Effectene®, erreichten geringe Transfektionseffizienzen bei HASMC und A-10 SMC. Humane Aortaendothelzellen wurden bisher als schwer zu transfizierende Zellen beschrieben. Die Untersuchungen in dieser Arbeit konnten zeigen, dass Superfect® und DAC-30® zu einer erfolgreichen Transfektion von HAEC führten. Weitere liposomale Transfektionsreagenzien, wie DC-30® und Lipofectin®, zeigten nur eine sehr ge-ringe Transfektion von HAEC. Auch Systeme, die aus einer Kombination von Lipiden und DNA-kondensierenden Reagenzien bestehen, wie Effectene® und LipofectAmine Plus®, transfizierten nur vereinzelte HAEC. Keinerlei Transfektion wurde mit FuGene 6® erreicht. Im Hinblick auf eine GMP-gerechte Herstellung in upscalebarem Rahmen sind von den untersuchten Reagenzien die beiden Lipide DC-30® und DAC-30® als am besten geeignet einzustufen.
Zur Produktion von in vivo einsetzbaren, stabilen Formulierungen wurde im Rahmen dieser Arbeit eine Herstelltechnik entwickelt, die zu physikalisch stabilen Lipoplexen führt. Bei diesem Verfahren handelt es sich um ein kontinuierliches Mischen von DNA und Lipid mit Hilfe einer Schlauchpumpe und eines Y-Stücks mit anschließender Lyophilisation der Lipoplexe. Die DNA und das Lipid werden mit einem konstanten Verhältnis und konstanter Geschwindigkeit zusammengepumpt, wodurch der Einfluss der Mischreihenfolge ausgeschlossen werden kann. Zusätzlich werden extrudierte Liposomen eingesetzt, so dass von einer homogenen Liposomengröße ausgegangen werden kann. Diese Methode ist ein-fach und upscalebar, da durch den kontinuierlichen Prozess Formulierungen mit Volumina bis in den Litermaßstab hergestellt werden können. Nach diesem Verfahren hergestellte Lipoplexe aus DC-30® und DAC-30® und einem GFP-exprimierenden Plasmid erreichten vergleichbare Transfektionseffizien-zen bei HASMC und A-10 SMC wie herkömmlich im kleinen Maßstab im Mikroreaktionsgefäß herge-stellte Lipoplexe. Nur die im Mikroreaktionsgefäß erzielte Transfektionseffizienz von HAEC konnte mit diesen Lipoplexen nicht erreicht werden. Zur Optimierung des Herstellverfahrens wurden mehrere Parameter (Transfektionsmedium, Extrusion des Lipids, Y-Stück-Größe) variiert und der Einfluss auf die Transfektionseffizienz und Größe der Lipoplexe untersucht. Nach Redispergieren von lyophilisier-ten Lipoplexen konnte eine Reproduzierbarkeit der Lipoplexgröße von Vial zu Vial und von Charge zu Charge nachgewiesen werden. Dieses Verfahren wurde erfolgreich auf ein therapeutisch wirksames Plasmid übertragen.
Zur Verbesserung der Qualitätskontrolle von Lipidmischungen konnte ein neues Verfahren zur gleich-zeitigen Analyse von Cholesterolderivaten (anhand von DC-Chol und DAC-Chol) und Phospholipiden (am Beispiel von DOPE) entwickelt werden. Mittels der Kombination aus Dünnschichtchromatographie und einer Detektion über Flammenionisation konnten quantitative Lipidanalysen durchgeführt werden, die eine relative Standardabweichung zwischen 1 bis 6% aufwiesen. Es konnte eine kalibrierbare und reproduzierbare Methode zur Lipidanalytik entwickelt werden, die die quantitative Analyse von DC-30® und DAC-30® ermöglicht.","Purpose of the first part of this study was the evaluation of a non-viral transfection reagent in respect to efficient gene transfer into primary human aorta smooth muscle and endothelial cells as target cells for cardiovascular indications.
Complexes consisting of seven commercially available transfection reagents (DAC-30, DC-30, Lipofectin, LipofectAMINE PLUS, Effectene, FuGene 6 and Superfect) and EGFP encoding plasmid DNA were studied. The in vitro transfection efficiency in human aorta smooth muscle cells (HASMC), human aorta endothelial cells (HAEC) and rat smooth muscle cells (A-10 SMC) were assayed in the presence of serum using flow cytometric analysis.
In the second part of the study a continuous mixing technique for large-scale preparation of lipoplexes with following lyophilisation for increased stability and shelf life has been developed. Resulting lipoplexes were analysed for transfection efficiency again in HASMC, HAEC and A-10 SMC. Homogeneity of lipid/DNA-products was investigated by PCS. Studies have been undergone with DAC-30, a commercially available composition of DAC-Chol and DOPE and a GFP producing marker plasmid. Continuous mixing technique was compared to preparation of lipoplexes by pipetting in small scale. Single steps of the continuous mixing process have been evaluated for optimising manufacturing technique. As there were: lipid/plasmid ratio, composition of transfection medium, pre-treatment of lipid, size of mixing device and influence of lyophilisation process. The combination of continuous mixing and lyophilisation shows to improve lipoplex characteristics."]},{"key":"dc:format.medium","label":"Dc Format Medium","values":["application/pdf"]},{"key":"dc:title","label":"Title","values":["Entwicklung einer nicht-viralen upscalebaren Formulierung zur Transfektion humaner vaskulärer Endothelzellen und glatter Muskelzellen","Evaluation of a non-viral upscalable formulation for transfection of vascular endothelial cells and smooth muscle cells"]}]}],"canonical_facts":{"dc:contributor":["Peschka-Süss, Regine"],"dc:creator":["Kiefer, Karin"],"dc:description.abstract":["Das Ziel dieser Arbeit war es, eine Formulierung auf der Basis von Lipiden oder Polymeren zu entwi-ckeln, die humane vaskuläre Endothelzellen und glatte Muskelzellen mit hoher Effizienz transfizieren kann und GMP-gerecht und upscalebar herstellbar ist.
Zur gentherapeutischen Behandlung der Arteriosklerose ist es nötig, einen Ersatz für virale Carrier-systeme zu finden, da diese zwar effektiv, aber immunogen bzw. krebsbildend wirken können. Diese nicht-viralen Systeme dürfen den viralen in ihrer Effizienz nicht nachstehen, aber sollten weniger to-xisch, nicht immunogen und einfacher und im großen Maßstab herstellbar sein.
Dazu wurden Zellmodelle aus humanen Aortaendothelzellen (HAEC), humanen glatten Aortamuskel-zellen (HASMC) und einer Rattenzelllinie (A-10 SMC) als Kontrollzelllinie sowie eine Methode zur quantitativen Bestimmung von GFP mittels Durchflusszytometrie als Transfektionsnachweis etabliert. In Screeningversuchen wurden die kommerziell erhältlichen nicht-viralen Systeme Superfect®, FuGe-ne 6®, Effectene®, LipofectAmine Plus®, Lipofectin®, DC-30® und DAC-30® mit den drei Zellarten in Gegenwart von Serum getestet und Einflussfaktoren auf die Transfektionseffizienz untersucht. Zusätz-lich wurden Abhängigkeiten der Transfektion von der Zellart, Passagezahl der Zellen, Aggregatgröße, der Mischreihenfolge von Transfektionsreagens und DNA und der Ladungsverhältnisse der Aggregate untersucht. FuGene 6®, Superfect®, DC-30® und DAC-30® stellten sich als die besten Transfektions-reagenzien für glatte Aortamuskelzellen des Menschen (HASMC) und der Ratte (A-10 SMC) heraus. Weitere untersuchte Transfektionsreagenzien, wie Lipofectin®, LipofectAmine Plus® und Effectene®, erreichten geringe Transfektionseffizienzen bei HASMC und A-10 SMC. Humane Aortaendothelzellen wurden bisher als schwer zu transfizierende Zellen beschrieben. Die Untersuchungen in dieser Arbeit konnten zeigen, dass Superfect® und DAC-30® zu einer erfolgreichen Transfektion von HAEC führten. Weitere liposomale Transfektionsreagenzien, wie DC-30® und Lipofectin®, zeigten nur eine sehr ge-ringe Transfektion von HAEC. Auch Systeme, die aus einer Kombination von Lipiden und DNA-kondensierenden Reagenzien bestehen, wie Effectene® und LipofectAmine Plus®, transfizierten nur vereinzelte HAEC. Keinerlei Transfektion wurde mit FuGene 6® erreicht. Im Hinblick auf eine GMP-gerechte Herstellung in upscalebarem Rahmen sind von den untersuchten Reagenzien die beiden Lipide DC-30® und DAC-30® als am besten geeignet einzustufen.
Zur Produktion von in vivo einsetzbaren, stabilen Formulierungen wurde im Rahmen dieser Arbeit eine Herstelltechnik entwickelt, die zu physikalisch stabilen Lipoplexen führt. Bei diesem Verfahren handelt es sich um ein kontinuierliches Mischen von DNA und Lipid mit Hilfe einer Schlauchpumpe und eines Y-Stücks mit anschließender Lyophilisation der Lipoplexe. Die DNA und das Lipid werden mit einem konstanten Verhältnis und konstanter Geschwindigkeit zusammengepumpt, wodurch der Einfluss der Mischreihenfolge ausgeschlossen werden kann. Zusätzlich werden extrudierte Liposomen eingesetzt, so dass von einer homogenen Liposomengröße ausgegangen werden kann. Diese Methode ist ein-fach und upscalebar, da durch den kontinuierlichen Prozess Formulierungen mit Volumina bis in den Litermaßstab hergestellt werden können. Nach diesem Verfahren hergestellte Lipoplexe aus DC-30® und DAC-30® und einem GFP-exprimierenden Plasmid erreichten vergleichbare Transfektionseffizien-zen bei HASMC und A-10 SMC wie herkömmlich im kleinen Maßstab im Mikroreaktionsgefäß herge-stellte Lipoplexe. Nur die im Mikroreaktionsgefäß erzielte Transfektionseffizienz von HAEC konnte mit diesen Lipoplexen nicht erreicht werden. Zur Optimierung des Herstellverfahrens wurden mehrere Parameter (Transfektionsmedium, Extrusion des Lipids, Y-Stück-Größe) variiert und der Einfluss auf die Transfektionseffizienz und Größe der Lipoplexe untersucht. Nach Redispergieren von lyophilisier-ten Lipoplexen konnte eine Reproduzierbarkeit der Lipoplexgröße von Vial zu Vial und von Charge zu Charge nachgewiesen werden. Dieses Verfahren wurde erfolgreich auf ein therapeutisch wirksames Plasmid übertragen.
Zur Verbesserung der Qualitätskontrolle von Lipidmischungen konnte ein neues Verfahren zur gleich-zeitigen Analyse von Cholesterolderivaten (anhand von DC-Chol und DAC-Chol) und Phospholipiden (am Beispiel von DOPE) entwickelt werden. Mittels der Kombination aus Dünnschichtchromatographie und einer Detektion über Flammenionisation konnten quantitative Lipidanalysen durchgeführt werden, die eine relative Standardabweichung zwischen 1 bis 6% aufwiesen. Es konnte eine kalibrierbare und reproduzierbare Methode zur Lipidanalytik entwickelt werden, die die quantitative Analyse von DC-30® und DAC-30® ermöglicht.","Purpose of the first part of this study was the evaluation of a non-viral transfection reagent in respect to efficient gene transfer into primary human aorta smooth muscle and endothelial cells as target cells for cardiovascular indications.
Complexes consisting of seven commercially available transfection reagents (DAC-30, DC-30, Lipofectin, LipofectAMINE PLUS, Effectene, FuGene 6 and Superfect) and EGFP encoding plasmid DNA were studied. The in vitro transfection efficiency in human aorta smooth muscle cells (HASMC), human aorta endothelial cells (HAEC) and rat smooth muscle cells (A-10 SMC) were assayed in the presence of serum using flow cytometric analysis.
In the second part of the study a continuous mixing technique for large-scale preparation of lipoplexes with following lyophilisation for increased stability and shelf life has been developed. Resulting lipoplexes were analysed for transfection efficiency again in HASMC, HAEC and A-10 SMC. Homogeneity of lipid/DNA-products was investigated by PCS. Studies have been undergone with DAC-30, a commercially available composition of DAC-Chol and DOPE and a GFP producing marker plasmid. Continuous mixing technique was compared to preparation of lipoplexes by pipetting in small scale. Single steps of the continuous mixing process have been evaluated for optimising manufacturing technique. As there were: lipid/plasmid ratio, composition of transfection medium, pre-treatment of lipid, size of mixing device and influence of lyophilisation process. The combination of continuous mixing and lyophilisation shows to improve lipoplex characteristics."],"dc:format.medium":["application/pdf"],"dc:subject":["humane vaskuläre Endothelzellen","humane glatte Muskelzellen","nicht-viraler Gentransfer","upscalebar","transfection efficiency","non-viral gene transfer","human endothelial cells","human smooth muscle cells","upscale"],"dc:title":["Entwicklung einer nicht-viralen upscalebaren Formulierung zur Transfektion humaner vaskulärer Endothelzellen und glatter Muskelzellen","Evaluation of a non-viral upscalable formulation for transfection of vascular endothelial cells and smooth muscle cells"],"dc:type":["DoctoralThesis"]},"updated_at":"2026-07-24T02:22:03Z"}