Vesículas extracelulares de microorganismos enológicos
Las comunidades microbianas constituyen sistemas manejables para estudiar cómo las interacciones ecológicas y los procesos evolutivos configuran la estructura, la función y la dinámica de los ecosistemas. La fermentación del mosto de uva en vino ofrece un sistema complejo pero controlable y reproducible, con un resultado medible y donde los microorganismos implicados son conocidos. Dentro de este contexto, Saccharomyces cerevisiae actúa como especie dominante al final de la fermentación gracias a las características genéticas propias del clado vínico (tolerancia a etanol y sulfitos, adaptación a baja disponibilidad de nitrógeno y alta osmolaridad), mientras que numerosas levaduras no-Saccharomyces y bacterias lácticas contribuyen de forma relevante a la cinética fermentativa y al perfil sensorial. Aunque se conocen mecanismos de comunicación inespecíficos y específicos, la contribución de las vesículas extracelulares en los mecanismos de comunicación en condiciones enológicas aún no ha sido detallada en profundidad. Esta tesis, siguiendo la línea de investigación de trabajos previos, profundiza en el rol de las vesículas extracelulares en la ecología microbiana del vino a través de varios enfoques. Debido a la ausencia de información sobre las vesículas extracelulares de otros microorganismos enológicos distintos a las levaduras, se caracterizó y estudió la composición proteica de las vesículas extracelulares de la bacteria láctica Oenococcus oeni. Posteriormente, se ha comparado la respuesta transcriptómica de S. cerevisiae a células o vesículas extracelulares de la levadura Metschnikowia pulcherrima y se ha identificado la tipicidad de las respuestas transcriptómicas de S. cerevisiae a la presencia de vesículas extracelulares de levaduras no-Saccharomyces. Por último, se aborda el desarrollo de un dispositivo de cocultivo en biorreactores para evaluar el efecto de vesículas extracelulares en el tiempo. Las vesículas extracelulares de O. oeni se aislaron mediante ultrafiltración y ultracentrifugación. Se caracterizaron mediante nanoparticle tracking analysis (NTA) y se estudió su contenido proteico. Se ha observado que O. oeni produce vesículas extracelulares con un proteoma enriquecido en proteínas ribosomales, proteínas integrales de membrana y enzima maloláctica, lo que sugiere funciones en comunicación y adaptación al medio. Las vesículas extracelulares de levaduras no-Saccharomyces se aislaron siguiendo el mismo protocolo y las respuestas transcriptómicas en S. cerevisiae se analizaron mediante RNA-seq. Se ha observado que las vesículas extracelulares de M. pulcherrima inducen en S. cerevisiae una respuesta transcriptómica similar a la del cocultivo, con sobreexpresión de genes ribosomales y de biosíntesis de aminoácidos, e inhibición de autofagia, indicando aceleración del crecimiento. Las vesículas extracelulares de Hanseniaspora uvarum, Candida sake y Torulaspora delbrueckii provocan respuestas comunes: activación de biogénesis ribosomal y represión del catabolismo de disacáridos y transportadores de alta afinidad. También se observan diferencias propias de cada especie en la intensidad de la respuesta y en la expresión diferencial de otras rutas metabólicas. Tras la evaluación de distintos dispositivos comerciales junto a un sistema de biorreactores conectados mediante membranas de filtración tangencial, este último resultó el más adecuado para estudiar interacciones mediadas por vesículas extracelulares, permitiendo seleccionar el paso de estructuras complejas y mantener condiciones fermentativas estables. En conclusión, esta tesis demuestra que las vesículas extracelulares son actores relevantes en la comunicación microbiana, capaces de modular la expresión génica de S. cerevisiae y potencialmente influir en la dinámica fermentativa. Además, aporta la primera caracterización proteómica de vesículas extracelulares en O. oeni y una plataforma experimental reproducible para estudios futuros. Estos hallazgos abren oportunidades para profundizar en los mecanismos de comunicación que gobiernan la ecología microbiana del vino.
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