Utilización de la proteína multicomponente Quimera de Leishmania infantum en inmunoprofilaxis y diagnóstico de leishmaniosis canina
Las estrategias propuestas para el control de la leishmaniosis canina se centran en el desarrollo de nuevos fármacos y generaciones de vacunas, así como de sistemas de diagnóstico fiables que permitan un mejor control de las endemias y brotes epidémicos de las diferentes formas de esta enfermedad emergente y en plena expansión. El desarrollo de una vacuna, capaz de controlar la enfermedad y de reducir significativamente la tasa de parásitos en los perros infectados, sería lo más deseable para la comunidad veterinaria y para la implantación de programas de control de la leishmaniosis visceral zoonótica. Además se hace necesario la búsqueda de antígenos del parásito que puedan ser empleados en el serodiagnóstico de la enfermedad. El presente trabajo describe los resultados obtenidos tras el análisis y cuantificación del grado de protección generado por la proteína Q de L. infantum en su ensayo como vacuna en perros tras la infección experimental de los animales. Igualmente se aportan datos relativos al efecto de dosis, vías de administración y determinación de la mejor formulación de un adyuvante para la PQ en su uso como vacuna contra la leishmaniosis canina. Además se detallan en esta memoria los resultados obtenidos tras el análisis del uso de la proteína Quimera como herramienta fiable de serodiagnóstico de dicha enfermedad. El modelo experimental (Sistema Test) para el desarrollo de estos estudios fue la especie canina (Canis familiaris), siendo 34 los perros utilizados para los ensayos de vacunación. Dichos animales procedían del Servicio de Animalario de la Universidad de Extremadura, siendo algunos ejemplares aportados por el Servicio de Animalario de la Facultad de Medicina de la Universidad de Murcia.Los animales eran de raza Beagle y mestizos (sin pureza racial alguna) y con madurez inmunológica, siendo sus edades las comprendidas entre los 8 y 18 meses, de ambos sexos y con un peso corporal según su estándar racial. Durante el desarrollo de los diferentes estudios, los animales permanecieron en las instalaciones del Servicio de Animalario de la Universidad de Extremadura del Campus Universitario de Cáceres, siendo las características de ubicación y manejo las descritas en la normativa nacional y europea referentes al cuidado y bienestar de animales de experimentación (Directiva del Consejo de 24 de Noviembre de 1986 relativa a la protección de los animales utilizados para experimentación y otros fines científicos (86/609/CEE)). Las proteínas recombinantes utilizadas como vacunas fueron cedidas por el Dr. Carlos Alonso Bedate, siendo aisladas y caracterizadas por el equipo de investigación del centro de Biología Molecular ¿Severo Ochoa¿ de Madrid. Se plantearon y se llevaron a cabo diferentes programas de vacunación para cada grupo de perros. Así, los perros pertenecientes al grupo C fueron inmunizados tres veces utilizando la proteína Q en adyuvante BCG, siendo la vía de administración la intraperitoneal; los animales del grupo D fueron inmunizados, igualmente tres veces con la proteína Quimera y la proteína de membrana Kmp11, adyuvadas en BCG, pero a través de la vía subcutánea. Igualmente se utilizó un grupo control de Adyuvante (Grupo A), siendo vacunados con BCG y 3 perros a los que no se les administró ninguna sustancia inmunogénica, pasando a ser los controles de la infección experimental (Grupo T). Estos animales (Grupos C, D, A y T) fueron los utilizados en el ENSAYO 1 para comprobar los índices de protectividad frente al reto de la infección experimental. Los animales pertenecientes al grupo E fueron inmunizados una sola vez con la vacuna marcada como PQ, administrada vía subcutánea y sin adyuvante, mientras que a los del grupo F se les vacunó con la PQ, en adyuvante BCG, una sola vez, y empleando la vía subcutánea en dos animales y la intraperitoneal en el resto. Por último los animales pertenecientes a los grupos G, H e I fueron inmunizados vía subcutánea con una dosis de PQ en adyuvante CpG/ODN, AlOH y QuilA, respectivamente. Igualmente se utilizó un grupo control de Adyuvante (Grupo A¿). Todos estos últimos grupos formaron parte del ENSAYO 2 referido al efecto de dosis, vías y adyuvantes sobre la respuesta inmune humoral frente a la PQ. Una vez demostrada la inocuidad de estas sustancias y la eficacia de estos productos como estimuladores del sistema inmune, los perros pertenecientes a los grupos C (PQ-BCG), D (PQ-Kmp11-BCG), A (BCG) y T (PBS) fueron sometidos al reto de la infección experimental (por inoculación endovenosa de 500.000 formas promastigote del parásito). La especie de Leishmania utilizada para su uso en la infección experimental, así como para la obtención de antígeno total soluble del parásito fue Leishmania infantum con código de la OMS M/CAN/ES/96/BCN 150 tipificado como zimodema 1 y aislada en nuestro Laboratorio a partir de un perro con leishmaniosis visceral naturalmente adquirida. A lo largo de la experiencia se llevaron a cabo diferentes estudios clínicos, parasitológicos, inmunológicos y biopatológicos in vivo, concluyendo la experiencia con el sacrificio de los animales de estudio y posterior realización de la necropsia reglada y análisis histopatológico de las muestras y tejidos obtenidos. Para los estudios de fiabilidad diagnóstica, incluídos en el ENSAYO 3, se analizaron un total de de 142 sueros caninos, procedentes de nuestros archivos de historias clínicas y muestras biológicas congeladas, obtenidas en la consulta de Parasitología y Enfermedades Parasitarias del Hospital Clínico Veterinario sito en la Facultad de Veterinaria de Cáceres. Así se testaron diferentes sueros de perros sanos (Grupo 1), sueros de perros con patologías diversas propias de la especie, excluyendo la infección por Leishmania infantum (Grupo 2), y un grupo de sueros de perros con leishmaniosis confirmada por distintas técnicas (Grupo 3). Por último se sometió a estudio un grupo de 10 perros con leishmaniosis canina, tratados con antimoniales y alopurinol antes y después del tratamiento (Grupo 4). El estudio de la eficacia diagnóstica de la proteína Q se llevó a cabo a través del análisis comparativo entre las técnicas más frecuentemente empleadas en el serodiagnóstico de la leishmaniosis canina, la técnica de Inmunofluorescencia Indirecta y la técnica de micro-ELISA indirecto con el habitual extracto crudo soluble como antígeno (SLA), frente al antígeno multicomponente recombinate PQ de L. infantum, tanto en el formato ELISA como en el inmunocromatográfico. En los ensayos de vacunación se pudo demostrar la capacidad inmunoestimuladora de la proteína Quimera de L. infantum, ya que indujo sola (Grupo E) o independientemente del adyuvante utilizado (resto de grupos), una respuesta positiva de anticuerpos durante todo el periodo de inmunización. Asímismo se pudo comprobar la inocuidad de las sustancias vacunales por cuanto no se observaron fenómenos de hipersensibilidad o toxicidad en los animales vacunados. Respecto a la respuesta de anticuerpos mediada por las dos subclases de inmunoglobulinas, los datos obtenidos mostraron una intensa activación de la subclase IgG2 en todos los grupos de animales, al ser enfrentados sus sueros a los antígenos homólogos, mientras que los niveles de IgG1 observados fueron muy variables, siendo significativos sólo en los animales inmunizados con PQ en adyuvante CpG/ODN, AlOH y Quil A, respectivamente. Así, la vía subcutánea y el empleo de dichos adyuvantes determinaron la mayor precocidad, intensidad y duración de la respuesta inmune, siendo el efecto de dosis y número de inoculaciones un factor de importancia mínima en la activación de dicha respuesta. Los resultados pusieron de manifiesto, igualmente que la respuesta inmunológica de base humoral fue específica para los determinantes antigénicos utilizados. El uso de la proteína Q en posibles planes de inmunprofilaxis de la leishmaniosis canina permitiría distinguir entre anticuerpos vacunales y de infección, ya que durante el periodo de inmunización la seropositividad por ELISA quedó exclusivamente restringida a este antígeno multicomponente, siendo las técnicas de IFI y ELISA (proteínas totales) negativas en los perros vacunados de todos los grupos, con la excepción de los inmunizados con Kmp11. Así, dicho antígeno de membrana utilizado como vacuna generaría anticuerpos crorreactivos frente a antígenos totales por la técnica ELISA. La infección experimental llevada a cabo fue totalmente efectiva, desarrollándose en todos los casos una leishmaniosis canina de tipo crónico expresada en formas latentes de escasa sintomatología y formas patentes o sintomáticas. Sin duda el éxito de la infección experimental permitió el análisis completo de los grados de protectividad obtenidos por el uso de las vacunas y el conocimiento de los posibles mecanismos involucrados. Así, y desde el punto de vista clínico, los animales vacunados no presentaron síntomas o alteraciones analíticas propias de la enfermedad. Los resultados parasitológicos demostraron la capacidad de la PQ para controlar el desarrollo de la infección, siendo los títulos por IFI en dichos animales negativos o basales durante toda la experiencia. El Test de Montenegro fue claramente positivo en todos los perros vacunados y los estudios anatomopatológicos e histológicos mostraron la ausencia de las lesiones propias de la leishmaniosis visceral a nivel hepático, renal o linforreticular. Por el contrario los animales control de Adyuvante (Grupo A) y no inmunizados (Grupo T) mostraron ya a los 150 días tras la infección y hasta el final del estudio signos de enfermedad, junto a niveles de anticuerpos claramente positivos por IFI y ELISA (tanto al SLA como a los de membrana Kmp11). La respuesta inmune de base celular mediante la DTH fue inexistente y en dichos perros fueron aislados parásitos durante todo el periodo de análisis. Los estudios anatomopatológicos e histológicos pusieron de manifiesto la existencia en los animales testigos de las típicas lesiones propias de esta enfermedad como distintos tipos de glomerulonefritis y nefritis intersticial, hepatitis, etc. Tras interpretar los resultados obtenidos en los estudios de diagnóstico, podemos afirmar que el empleo el antígeno recombinante PQ de L. infantum ofrece una alta fiabilidad en el serodiagnóstico de la leishmaniosis canina, y un cierto valor pronóstico por cuanto fue capaz de detectar seropositividad en aquellas formas susceptibles con enfermedad establecida (formas sintomáticas) o evolutivas (formas latentes en fases preclínicas), y mostrar reacción negativa de anticuerpos en aquellos perros presumiblemente con respuesta inmunitaria baja y de control al desarrollo de la enfermedad (formas regresivas y latentes no evolutivas). Además, la mejoría clínica y eliminación de parásitos que acompaña a un tratamiento leishmanicida efectivo, se tradujo en una seroconversión hacia la negatividad frente a los componentes del antígeno, de forma similar a lo que se observó cuando se empleó la técnica IFI. En vista de los resultados obtenidos podemos concluir que la proteína recombinante multicomponente Quimera de Leishmania infantum se muestra como una excelente herramienta para el control de la leishmaniosis canina por cuanto se muestra como una herramienta fiable de diagnóstico y un excelente candidato vacunal.
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