Detección de un polimorfismo marcador de sexo mediante CRISPR-CAS 12A en salmón coho

En salmon Coho se ha identificado un marcador genético asociado al sexo que corresponde a la variación estructural del gen GH-2. Esta variante permite determinar el sexo considerando diversas metodologías, tales como PCR asociado a un ensayo de enzima de restricción y “high resolution melting” (HRM), no obstante requieren de equipos especializados y en algunos casos son muy laboriosas de implementar en la práctica. El sistema CRISPR-Cas permite la detección de nucleótidos utilizando el mecanismo de acción de la enzima Cas 12a, que reconoce una secuencia de ADN específica dirigido por un ARN guía, la cual desencadena una actividad colateral de corte permitiendo a través de reporteros detectar mediante fluorescencia las secuencia objetivo. Dado que esta técnica es posible de realizar de manera portátil sin comprometer parámetros analíticos, se propone a CRISPR-Cas 12a como candidato para la detección de nucleótidos. El objetivo de este trabajo es desarrollar un sistema de detección de secuencias especificas asociadas al sexo en salmon Coho mediante CRISPR-Cas 12a, acoplado a PCR o a la amplificación con recombinasa polimerasa (RPA), permitiendo la detección mediante fluorescencia directa. En primer lugar, se determinó el sexo de muestras de individuos mediante ensayo de restricción HinfI, y se realizó el procedimiento de secuenciación SANGER para determinar los controles de reacción. Además, se desarrolló una prueba de identificación de sexo mediante HRM la cual es nuestro ensayo de referencia o “gold standard”. El sistema CRISPR/cas12 se implementó para la detección de una inserción presente en machos, dónde se diseñó un ARN guía adyacente a un sitio PAM. La visualización positiva de la fluorescencia discernible mediante un transiluminador UV se obtuvo utilizando relaciones mínimas de 20 nM, del complejo ARN guía y enzima Cas 12a, considerando una concentración mínima del amplicón obtenido mediante PCR a una concentración de 0,1 ng/μl. Los resultados fueron 10 positivos y 10 negativos considerando muestras de individuos control, definidas como macho y hembras respectivamente. Se generó un prototipo de campo mediante un ensayo CRISPR-Cas 12a acoplado a RPA. Los resultados señalaron diferencias en fluorescencia significativamente más altas en machos cuando se comparan con hembras. Al aplicar las diferentes técnicas de determinación de sexo: ensayo de restricción mediante HinfI, HRM, CRISPR-Cas 12a acoplado a PCR y CRISPR-Cas 12a acoplado a RPA, se logró un 100% de consistencia entre los distintos análisis. En conclusión, se desarrolló un prototipo de campo para la determinación del sexo en salmón Coho, el cual requiere como insumo el ADN de animales, obtenidos mediante un procedimiento estándar de extracción. Este método presenta un 100% de eficiencia para la detección temprana del sexo en esta especie, sin la necesidad de esperar grados avanzados de maduración gonadal, es de relevante para la implementación de poblaciones monosexo, lo cual permite un mejoramiento significativo de la rentabilidad del sector.

Grantor dc:publisher

Universidad de Chile

Year dc:date.issued

2023

Author dc:creator

• Mondaca Contreras, Camila Paz

Advisor dc:contributor.advisor

• Martínez Moncada, Víctor Agustín

• Salmón coho
• Polimorfismo genético

Statement dc:rights

• Attribution-NonCommercial-NoDerivs 3.0 United States

Licence dc:rights.uri

• http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/us/

Language dc:language.iso

es

Dc Identifier Other

10.58011/hhft-ef50

OAI identifier oai:identifier

oai:repositorio.uchile.cl:2250/197989