Desarrollo de estrategias analíticas de microextracción de compuestos estrogénicos desde matrices líquidas para ser evaluados por cromatografía líquida con analizador de tiempo de vuelo y detector de masas (LC-TOF/MS)

Los estrógenos son compuestos de origen natural como sintéticos que en el último tiempo han sido estudiados por ser considerados disruptores endocrinos. En humanos estos compuestos han producido enfermedades como: cáncer de mamas y próstata, desordenes del tracto reproductivo y bajo recuento de espermatozoides, entre otras, mientras que en organismos acuáticos se han detectados problemas de feminización, infertilidad, hermafrodismo e incluso la muerte. La estrona (E1), 17β-estradiol (E2) y estriol (E3) son los estrógenos más abundantes en el organismo, estos son producidos para regular funciones biológicas relacionadas con el crecimiento y ciclos reproductivos, tanto en humanos como en animales. En base a esta última función, se ha utilizado el estrógeno sintético 17α-etinilestradiol (EE2) como el principal compuesto activo de diferentes métodos anticonceptivos, también se ha reportado su uso para promover el crecimiento en animales. Los estrógenos son metabolizados en el hígado a través de 2 fases, donde es posible la formación de los metabolitos hidroxilados de E1 y E2 como 2-hidroxiestrona (2-OHE1), 4-hidroxiestrona (4-OHE1), 2-hidroxiestradiol (2-OHE2) y 4-hidroxiestradiol (4-OHE2) denominados catecol estrógenos, como también el metabolito hidroxilado 16-hidroxiestrona (16-OHE1), todos los anteriores han sido correlacionados con el desarrollo de distintos tipos de cánceres, a través de su transformación a semiquinonas y finalmente a quinonas, capaces de formar aductos con el ADN y producir mutaciones en los organismos. Determinar la presencia de este tipo de compuestos en matrices ambientales, matrices biológicas y/o alimenticias, podría ayudar a evitar la exposición ante estos compuestos, sin embargo se necesita tener las metodologías analíticas que puedan dar cuenta de esta información. El objetivo de esta investigación fue desarrollar metodologías analíticas que permitan extraer y determinar en forma sensible y selectiva las hormonas sexuales E1, E2, EE2 y E3 y sus metabolitos hidroxilados desde muestras de aguas residuales y muestras biológicas como orina y leche, utilizando cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas (LC-MS). Se desarrolló una metodología de derivatización con cloruro de dansilo para obtener derivados altamente ionizables compatibles con la espectrometría de masas en modo positivo. Se utilizó un analizador de tiempo de vuelo (TOF) y un analizador de triple cuadrupolo (QqQ) acoplados a espectrometría de masas, donde se obtuvieron los productos derivatizados con señales m/z correspondientes a la forma [M+H]+ para EE2, E1, E2, E3, 16-OHE1 y la forma [M+2H]2+ para 2-OHE1, 4-OHE1, 2-OHE2 y 4-OHE2. Estas últimas señales no reportadas previamente fueron más intensas, desde 4 veces más que las formas [M+H]+ para 2-OHE1, 4-OHE1, 2-OHE2 y 4-OHE2. Los 9 estrógenos fueron determinados instrumentalmente en corridas cromatográficas menores a 10 min, con coeficientes de correlación mayores a 0,994. Para la determinación de estos compuestos en muestras acuosas se utilizó la técnica de Extracción por Sorción en Disco Rotatorio (RDSE) y la Extracción en Fase Sólida (SPE). Mediante RDSE se logró desarrollar una metodología de extracción de estrógenos desde efluentes de plantas de tratamiento de aguas residuales (PTAR) utilizando la fase sorbente estireno-divinilbenceno (e-DVB), obteniendo recuperaciones entre el 79 y 118%, con desviaciones estándares relativas (RSD) menores al 16%. Los límites de detección (LD) y cuantificación (LC) del método estuvieron entre 0,001 y 0,012 μg·L-1 y entre 0,004 y 0,038 μg·L-1, respectivamente. La metodología fue aplicada sobre dos efluentes de PTARs de la Región Metropolitana de Santiago, pudiéndose cuantificar E1 en concentraciones de 0,012±0,003 μg·L-1 y 0,013±0,001 μg·L-1 en cada uno de ellos, mientras que E2 y EE2 fueron detectados en concentraciones por debajo del LC. Al utilizar SPE con C18 se obtuvieron recuperaciones en agua potable y en efluente sobre el 86% con valores de RSD entre el 3 y 16%, mientras que los límites de detección y cuantificación del método estuvieron entre 0,002 y 0,017 μg·L-1 y entre 0,006 y 0,058 μg·L-1. Se analizó una muestra de efluente de PTAR detectando y cuantificando E1 y E2 en concentraciones de 0,007±0,001 μg·L-1 y 0,041±0,010 μg·L-1, respectivamente. Para la extracción de estrógenos desde leche se utilizó la metodología QuEChERS citrato y para limpiar el extracto obtenido se utilizó SPE con el sorbente divinilbenceno-co-N-vinilpirrolidona, obteniéndose recuperaciones entre el 90 y 123% con valores de RSD menores al 18%. Los límites de detección y cuantificación de la metodología QuEChERS acoplada a SPE estuvieron entre 0,02 y 0,13 μg·L-1 y entre 0,05 y 0,53 μg·L-1, respectivamente. Se aplicó la metodología a muestras de leche obtenidas desde bovino lactante, bovino con 7 meses gestación y desde centros comerciales, lográndose determinar la presencia de E1 en una concentración de 0,094 μg·L-1 en la leche de bovino en gestación. Por otra parte, se aplicó una metodología de hidrólisis enzimática sobre muestras de leche obtenidas desde tiendas comerciales pudiéndose encontrar E1 en 3 muestras analizadas, encontrándose a una concentración bajo el límite de cuantificación en las muestras no hidrolizadas y en concentraciones entre 0,086 y 1,3 μg·L-1. En orina se utilizó RDSE para la extracción de estrógenos y en forma simultanea se utilizó una amina primaria secundaria (PSA) para reducir la cantidad de interferentes provenientes de esta matriz. La metodología de extracción fue optimizada y validada, mostrando recuperaciones entre el 72 y el 130% y RSD menores al 17%. Los límites de detección y cuantificación estuvieron entre el 0,10 y 0,13 μg·L-1 y entre 0,30 y 0,50 μg·L-1, respectivamente. La metodología fue utilizada para analizar muestras de orina de mujeres de 29, 35 y 53 años de edad, 2 mujeres embarazadas con 27 y 28 semanas de gestación, y una muestra de un hombre de 29 años, se aplicó un tratamiento enzimático con la enzima β–glucuronidasa previo a la extracción, a modo de determinar la cantidad de estrógenos totales, como también se analizaron las muestras sin tratamiento enzimático para determinar la cantidad de estrógenos libres. Se lograron detectar los 9 estrógenos estudiados entre las diferentes muestras analizadas, en concentraciones de 0,9 a los 73 μg·L-1 en su forma libre y entre 0,5 y 1542 μg·L-1en su forma conjugada, obteniéndose concentraciones totales que llegan hasta los 1615 μg·L-1 por analito. Las mayores concentraciones se encontraron en las muestras de orina de mujeres en gestación, siendo E3 el estrógeno encontrado en mayor concentración. Se pudo concluir que las metodologías desarrolladas permitieron determinar 8 estrógenos naturales y 1 sintético mediante metodologías simples y rápidas con buenos niveles de linealidad, selectividad, sensibilidad, exactitud y precisión en las tres matrices analizadas, donde la técnica RDSE fue adecuada para la extracción de estrógenos en matrices complejas de carácter principalmente polar como aguas y orina, mientras que QuEChERS resultó ser una metodología eficiente para la extracción de estrógenos desde matrices complejas de carácter mayormente apolar. La técnica RDSE mostró figuras de mérito similares a otras técnicas con amplio desarrollo como SPE, mientras que la metodología QuEChERS permitió la extracción de estrógenos desde leche a niveles comparables con otras investigaciones, permitiendo cuantificar E1 en las muestras de leche analizadas. La cromatografía de líquidos acoplada a espectrometría de masas resultó una técnica fundamental en la detección, confirmación y cuantificación de estos compuestos, debido a la capacidad de separación de compuestos con similares propiedades físico-químicas y a la determinación sensible y selectiva que fue posible en muestras de alta complejidad. Se determinó que la orina es una importante fuente de contaminación de estrógenos, ya que a través de la orina llegan estrógenos hacia aguas residuales, las que posteriormente son descargadas hacia el medio ambiente pudiendo afectar a la fauna acuática y otras especies que tienen interacción directa con estas aguas. Por otra parte, los humanos podríamos estar incorporando estrógenos a nuestros organismos a través de la leche, ya que si esta es extraída en bovinos que se encuentran sobre el 3er trimestre de gestación, los niveles hormonales podrían estar en torno a 1000 veces más altos que en un bovino en condiciones normales

Grantor dc:publisher

Universidad de Chile

Year dc:date.issued

2020

Author dc:creator

• Honda Soto, Luis Yerko

Advisor dc:contributor.advisor

• Richter Duk, Pablo

• Estrógenos
• Extracción (Química)
• Cromatografía líquida

Statement dc:rights

• Attribution-NonCommercial-NoDerivs 3.0 Chile

Licence dc:rights.uri

• http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/cl/

Language dc:language.iso

es

Repository record dc:identifier.uri

https://repositorio.uchile.cl/handle/2250/176741

OAI identifier oai:identifier

oai:repositorio.uchile.cl:2250/176741