Characterization of the type VI protein secretion system encoded in the Salmonella pathogenicity island 19 and its role in the pathogenicity of serotypes Gallinarum and Enteritidis

El genero Salmonella comprende a mas 2,500 serotipos conocidos distribuidos en dos especies: enterica y bongori. Estos serotipos difieren mucho en términos de patogenicidad y especificidad hospedero. Dos serotipos de Salmonella entérica son de especial relevancia: los serotipos Gallinarum y Enteritidis. S. Gallinarum presenta un rango hospedero restringido a aves y causa una severa enfermedad sistémica conocida como tifoidea aviar, la que causa grandes perdidas económicas en la producción aviar en distintas partes del mundo. S. Enteritidis, en cambio, infecta a un amplio rango de hospederos incluyendo humanos, ratones y aves. A diferencia de S. Gallinarum, S. Enteritidis genera una infección subclinica en los pollos, y las aves infectadas pueden convertirse en portadores crónicos, poniendo huevos contaminados por Salmonella. El consumo humano de productos aviares o huevos resulta en un cuadro de gastroenteritis aguda autolimitante, la cual es responsable por ~61% del 1.5 millones de casos de salmonelosis reportados entre los años 1995 y 2008 (WHO Global Foodborne Infections Network Country Databank). Existen pocos trabajos realizados sobre los mecanismos moleculares detrás de la adaptación al hospedero aviar y sobre las implicancias clínicas de las infecciones causadas por los serotipos Enteritidis y Gallinarum, sin embargo evidencia reciente sugiere que estos serotipos poseen factores de virulencia no descritos que pueden ser responsables de estas diferencias. La interación entre las bacterias y sus hospederos es guiada por una comunicación dinámica que busca influenciar la respuesta del hospedero. Dentro de las herramientas utilizadas por las bacterias para influir la respuesta de sus hospederos, las maquinas secretoras que entregan proteínas y toxinas hacia el ambiente intracelular de sus blancos eucariontes son cruciales para la supervivencia y virulencia bacteriana. El Sistema de Secreción Tipo VI (T6SS) es un nuevo mecanismo de translocación de proteínas que existe en la mayoría de bacterias Gram-negativo que se encuentran en contacto íntimo con células eucariontes, incluyendo a aquellas que son patógenos humanos y de plantas. El papel preciso que cumplen estos T6SS todavía es desconocido pero es claro que cumple un papel importante en la virulencia bacteriana. En Salmonella enterica, solo se ha descrito un T6SS el cual esta codificado en la Isla de Patogenicidad 6 de Salmonella (SPI-6). En esta tesis, a través de análisis bioinformaticos y de genomica comparativa se determinó que el genero Salmonella codifica 5 T6SS, distribuidos diferencialmente entre distintos serotipos y con historias evolutivas diferentes. Los nuevos T6SS fueron identificados en islas genómicas designadas SPI-19, SPI-20, SPI-21 and SPI-22. Ademas de la identificación de estas islas, una nueva proteína VgrG “evolucionada” con un dominio del tipo S-Piocina fue identificado en SPI-21. La presencia de este dominio sugirió por primera vez un papel de los T6SS en muerte bacteriana, abriendo un nuevo capitulo en el estudio de T6SS y su papel en relaciones interbacterianas. El T6SS de SPI-19 fue de especial relevancia debido a su amplia distribución dentro de serotipos virulentos de Salmonella y porque análisis bioinformaticos mostraron que mientras Gallinarum codifica un T6SS completo, el serotipo Enteritidis solo codifica para remanentes de este sistema. A pesar de estar estrechamente relacionados, los serotipos Gallinarum y Enteritidis presentan diferencias profundas en su rango de hospederos y patogenicidad. Por lo tanto, es posible especular que la presencia de un T6SS activo esta relacionada de alguna manera con las diferencias en especificidad hospedero y patogenicidad presentada por estos dos serotipos. Para resolver esta hipótesis y determinar la contribución de SPI-19 a la patogenicidad de Salmonella, el objetivo de esta tesis fue determinar si la isla genomica SPI-19 codifica un T6SS funcional que contribuye a la patogenicidad de Gallinarum y Enteritidis en el hospedero aviar. De manera de caracterizar el T6SS de SPI-19, fusiones génicas y de operon fueron construidas y la expresión, producción y secreción de componentes del T6SS fueron evaluadas bajo diferentes condiciones de crecimiento in vitro. El análisis mostro que la mayoría de los componentes se mantienen reprimidos bajo las condiciones analizadas. Infección de macrófagos murinos con una cepa de Gallinarum con una fusión entre el componente estructural/secretado VgrG al reportero GFP, mostró que los componentes del T6SS son preferencialmente producidos al interior de células infectadas. Mutantes por deleción no polares de la isla SPI-19 y componentes específicos del T6SS reveló que este T6SS es necesario para la supervivencia de Salmonella Gallinarum al interior de macrófagos a tiempos tardios de infección. Sin embargo, el T6SS de SPI-19 no pudo ser asociado muerte celular o citotoxicidad de macrófagos inducida por Salmonella. Para determinar la contribución del T6SS de SPI-19 a la patogenicidad de Salmonella, mutantes del T6SS fueron analizadas en ensayos de competencia contra la cepa silvestre de Gallinarum. Infección oral de pollos White Leghorn de cuatro días de edad, reveló que las mutantes del T6SS colonizaron pobremente el ileo, ciego, hígado y bazo comparado a la cepa silvestre. Restitución de SPI-19 a la mutante SPI- 19, utilizando el sistema VEX-Capture, complementó este defecto en colonización. Para analizar el impacto de poseer un T6SS completo en la habilidad de S. Enteritidis para colonizar al hospedero aviar, la SPI-19 de Gallinarum fue transferida a Enteritidis. Experimentos in vivo mostraron que la presencia de una SPI-19 completa aumento significatvamente la habilidad de Enteritidis para colonizar el ileo, hígado y bazo de pollos infectados al dia 1 post-infección. Sin embargo, esa ventaja en la colonización no fue duradera ya que esta cepa mostró un fuerte defecto en la colonización desde el día 3 post-infección hasta el final de los experimentos. Estos resultados sugieren que transferencia de SPI-19 desde S. Gallinarum tiene un impacto negativo en la habilidad de S. Enteritidis para colonizar el hospedero aviar. De esta forma podemos especular que perdida del T6SS de SPI-19 corresponde a un evento patoadaptativo durante la evolución de S. Enteritidis. Del mismo modo, este es el primer trabajo en el que se utiliza el método VEX-Capture para determinar el efecto de la transferencia de islas genómicas en un modelo animal de infección bacteriana. El reciente descubrimiento de Sistemas de Secreción Tipo VI (T6SS) ha abierto un nuevo capitulo en el estudio de la adaptación de Salmonella hacia sus hospederos y el medio ambiente. Si Salmonella codifica T6SS y si aquellos pueden ser considerados eventos evolutivos cuanticos, fueron algunas de las preguntas que el descubrimiento de los T6SS en los genomas bacterianos generó. En esta tesis, hemos expandido el actual conocimiento sobre los T6SS bacterianos y el potencial patogénico de Salmonella mediante: i) la identificación y descripción de 4 nuevas Islas de Patogenicidad de Salmonella (SPI-19, SPI-20, SPI-21 and SPI-22) que codifican para T6SS filogenéticamente distintos, ii) el descubrimiento de una nueva “VgrG” evolucionada que sugirió por primera vez un papel de los T6SS en relaciones interbacterianas, iii) identificando que el T6SS de SPI-19 contribuye a la supervivencia intracelular de Salmonella en macrófagos y iv) determinando que el T6SS de SPI-19 contribuye a la colonización de pollos por S. Gallinarum.

Grantor dc:publisher

Universidad de Chile

Year dc:date.issued

2011

Author dc:creator

• Blondel Buijuy, Carlos José

Advisors dc:contributor.advisor

• Contreras Osorio, Lucía Inés
• Santiviago Cid, Carlos

• Salmonella enteritidis
• Salmonella gallinarum

Statement dc:rights

• Attribution-NonCommercial-NoDerivs 3.0 United States

Licence dc:rights.uri

• http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/us/

Language dc:language.iso

en

Repository record dc:identifier.uri

https://repositorio.uchile.cl/handle/2250/105207

OAI identifier oai:identifier

oai:repositorio.uchile.cl:2250/105207