Automatic Label-Free system for cell viability on-a-chip [Sistema automatico Label-Free per la determinazione della vitalità cellulare su chip]
Le piattaforme microfluidiche sono emerse come strumenti potenti per l’analisi di campioni biologici di piccolo volume in ambienti controllati con precisione. Nel contesto della valutazione della vitalità cellulare, gli approcci convenzionali si basano tipicamente sulla marcatura chimica, una procedura invasiva, dispendiosa in termini di tempo e limitata ad analisi di tipo endpoint, che impedisce il riutilizzo dei campioni e richiede strumentazioni ingombranti e costose, come i citofluorimetri a flusso. Queste limitazioni hanno motivato lo sviluppo di sistemi automatici, non invasivi e portatili, in grado di valutare la vitalità cellulare direttamente on-a-chip, preservando l’integrità del campione e riducendo la complessità operativa. La presente tesi introduce un paradigma innovativo per il monitoraggio e la valutazione della vitalità cellulare, integrando l’attuazione idrodinamica con la rilevazione ottica all’interno di una piattaforma microfluidica denominata Hy-based μFlu Viability Analysis. Sfruttando la risposta meccano-biologica delle cellule sottoposte a stimolazione idrodinamica continua, l’approccio Hy-based μFlu Viability trasforma le dinamiche di movimento cellulare in biomarcatori quantitativi correlati alla vitalità. In particolare, è stato impiegato un algoritmo basato sulla Digital Particle Image Velocimetry (DPIV) per ricostruire i profili di velocità cellulare ed estrarre due biomarcatori legati alla risposta dinamica delle cellule nei domini del tempo e della frequenza, risultati efficaci per la classificazione della vitalità. Questa metodologia è stata completamente automatizzata tramite un framework algoritmico ciclico che esegue acquisizione video, analisi dei dati e visualizzazione a intervalli di tempo predefiniti (Time-Slot), consentendo un monitoraggio continuo e non supervisionato della vitalità delle popolazioni cellulari. L’affidabilità e la generalizzabilità del metodo sono state validate su diverse linee cellulari, tra cui HL60 e HeLa in differenti stati di vitalità, e confrontate con il test standard MTT, evidenziando una forte coerenza tra gli indicatori di vitalità metabolici e meccanici. Inoltre, per superare le esigenze computazionali intrinseche all’elaborazione basata su immagini e passare da un’analisi ciclica Time-Slot a una analisi in tempo reale, è stato sviluppato un modello di deep learning denominato Average Particles Velocity network (APVnet), capace di stimare la velocità cellulare in tempo reale, raggiungendo prestazioni a velocità video adatte all’implementazione su dispositivi edge. Infine, la metodologia è stata trasferita su due piattaforme tecnologiche compatte e portatili, colmando il divario tra ricerca di laboratorio e sistemi realmente implementabili. La prima è un microscopio a riflessione basato su smartphone, denominato Smart-Reflex-Scope, che sfrutta la fotocamera e il flash integrati del dispositivo per realizzare imaging on-a-chip mediante una configurazione ottica riflettente personalizzata. La seconda è un chip micro-optofluidico completamente integrato che sostituisce l’imaging a campo pieno con la rilevazione della velocità in-situ tramite segnali ottici basata sulla tecnica Dual-Slit Particle Signal Velocimetry (DPSV). Il sistema proposto rappresenta un passo significativo verso il monitoraggio automatico, label-free e in tempo reale della vitalità cellulare all’interno di chip microfluidici. Combinando idrodinamica, ottica, intelligenza artificiale e soluzioni portatili a basso costo, questo lavoro getta le basi per la prossima generazione di strumenti diagnostici point-of-care, promuovendo un’analisi biochimica accessibile, sostenibile e ricca di informazioni per applicazioni nella sanità decentralizzata e nella scoperta di nuovi farmaci.
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