NUOVE TECNICHE GENOMICHE APPLICATE AGLI AGRUMI PER L’OTTENIMENTO DI FRUTTI APIRENI

L’apirenia è una caratteristica molto ricercata negli agrumi e uno dei maggiori fattori che contribuisce al suo aumento di valore nel mercato. La presenza di semi nei frutti, spesso duri e di cattivo gusto, è un grande ostacolo per i consumatori che preferiscono i frutti con semi solo quando un’alternativa apirena non è disponibile. La mancanza di semi negli agrumi è un tratto complesso e può essere causato da diversi meccanismi quali ad esempio la presenza di sterilità maschile o femminile, la triploidia, la partenocarpia, quando la fecondazione dell’ovulo non avviene o la stenospermocarpia, quando invece lo sviluppo dei semi è interrotto a fecondazione avvenuta; in altri casi l’apirenia può essere causata da reazioni di auto-incompatibilità che impediscono la formazione del seme, specialmente se la varietà viene coltivata in blocchi isolati dove l’impollinazione incrociata è impedita. Per caratterizzare e descrivere le basi genetiche del meccanismo di auto-incompatibilità sono state studiate due varietà di clementina (Citrus clementina Hort. ex. Tan), uno dei gruppi varietali più diffusi nella regione Mediterranea. La cv. di clementine ‘Comune’ (auto-incompatibile) e la cv. ‘Monreal’, il suo mutante naturale auto-compatibile, sono state caratterizzate mediante un approccio integrativo che combina dati genomici e trascrittomici. In particolare è stato assemblato de novo il genoma di ‘Monreal’ ed è stato definito il genotipo del locus S delle due varietà, (‘Comune’ e ‘Monreal’) S7S11; il confronto delle reads ottenute tramite RNA-seq dei pistilli autoimpollinati di ‘Comune’ e ‘Monreal’ ha portato all’identificazione di 2965 geni differenzialmente espressi, molti dei quali sono responsabili di processi di ossidoriduzione e attività di trasporto trans-membrana e ha permesso di rilevare la mancanza di espressione dell’RNasi S7 in ‘Monreal’. Questi dati, allineati con il genoma di riferimento hanno permesso di identificare 7781 geni caratterizzati dalla presenza di uno o più SNP presenti nei due genotipi, per lo più localizzati nello scaffold 7, lo stesso che contiene il locus S, suggerendo il suo coinvolgimento nella regolazione dei geni coinvolti nell’auto-incompatibiltà. L’ottenimento di piante di agrumi apirene è stato perseguito a lungo utilizzando diverse tecniche; l’applicazione delle biotecnologie di seconda generazione, anche note come Nuove Tecniche Genomiche (NGTs) rappresenta una valida alternativa alle tecniche tradizionali, quali l’ibridazione, la mutagenesi e la selezione, in quanto consente di introdurre modifiche precise senza alterare il background genetico originale della varietà considerata. Tra questi, l'applicazione del genome editing in agrumi sembra molto promettente per il miglioramento di cultivar selezionate, specialmente per il silenziamento genico o per l’inserzione di geni e mutazioni che portano nuove caratteristiche; esso è stato applicato con successo per la modifica di geni coinvolti nella suscettibilità al cancro degli agrumi. In questa tesi, il sistema CRISPR/Cas9 è stato utilizzato con successo per silenziare il gene IKU1, coinvolto nella regolazione della dimensione del seme; la perdita di funzione delle mutazioni nei geni del pathway di HAIKU (IKU) causa una diminuzione della dimensione del seme nel mutante di Arabidopsis. Pertanto, è stato utilizzato un approccio a doppia guida per l’editing dell'omologo di IKU1 negli agrumi; la trasformazione è stata realizzata in tre genotipi di agrumi con semi, due specie modello e una varietà di arancio dolce. Sono state ottenute e analizzate sedici piante, confermando l’interruzione di sequenza nel gene IKU1 e l’assenza di alcuni amminoacidi nella proteina tradotta. In particolare, tra le piante editate, 4 campioni presentano una grande delezione di 327 bp tra le due guide sgRNA1 e sgRNA2, mentre 2 campioni presentano un’inversione. Le valutazioni fenotipiche, al momento non possibili a causa della lunga giovanilità, consentiranno di verificare e confermare il ruolo del gene IKU1 e la sua importanza per l’ottenimento di nuove varietà senza semi.

Grantor dc:publisher

Università degli studi di Catania

Year dc:date

2023

Author dc:creator

• POLES, LARA

Contributors dc:contributor

• LA MALFA, Stefano Giovanni

• CRISPR/Cas9, self-incompatibility, clementine, genome editing, transformation, regeneration, seed
• CRISPR/Cas9, autoincompatibilità, clementina, trasformazione, rigenerazione, semi

Statement dc:rights

• info:eu-repo/semantics/openAccess
• license:PUBBLICO - Pubblico con Copyright
• license uri:iris.PUB02

Language dc:language

ita

Handle dc:identifier

https://hdl.handle.net/20.500.11769/582160

OAI identifier oai:identifier

oai:www.iris.unict.it:20.500.11769/582160