Progettazione e studi preformulativi di formulazioni nanotecnologiche per la somministrazione intranasale di composti neuroattivi
Le malattie del sistema nervoso centrale (SNC) (disturbi neurologici, neurodegenerativi e dell'umore) sono in rapido aumento e colpiscono un'alta percentuale della popolazione mondiale. I fattori eziologici possono essere genetici o provenienti dall'ambiente esterno, che perturbano l'omeostasi del cervello. In particolare, questo progetto di tesi si concentra sul trattamento di malattie come la neuroinfiammazione e il dolore acuto/cronico, la schizofrenia, l'epilessia e l'insonnia. I farmaci tradizionali, nelle loro forme farmaceutiche attuali e somministrati attraverso le vie di somministrazione classiche, presentano diversi limiti, come la scarsa aderenza terapeutica, la bassa biodisponibilità nel sito bersaglio (il cervello), gli effetti collaterali, i dosaggi elevati e le somministrazioni frequenti. Inoltre, i farmaci utilizzati presentano una scarsa solubilità nelle soluzioni acquose, con conseguente bassa permeazione attraverso le membrane biologiche e biodisponibilità. Le nanotecnologie hanno fornito molteplici vantaggi: la somministrazione di farmaci scarsamente solubili, aggirando membrane difficili da attraversare (come la barriera emato-encefalica, BBB), la somministrazione mirata al sito bersaglio con conseguente aumento della biodisponibilità del farmaco e riduzione dei dosaggi, la possibilità di un rilascio prolungato del farmaco con conseguente riduzione della frequenza di somministrazione, la protezione del farmaco dall'ambiente esterno (ad esempio, dagli enzimi di degradazione), la riduzione della distribuzione del farmaco in siti fuori bersaglio, con conseguente riduzione degli effetti collaterali. Inoltre, recentemente è stata studiata una via di somministrazione innovativa, la via intranasale (IN), poco invasiva e facile da autosomministrare. Ad oggi, è considerata dalla comunità scientifica una valida alternativa alla via parenterale, in quanto consente un'elevata velocità d'azione, poiché il farmaco può essere captato dal nervo olfattivo e raggiungere direttamente il cervello, bypassando la BBB, oppure essere assorbito rapidamente dalla mucosa nasale, che è altamente vascolarizzata, per raggiungere il cervello. Tuttavia, presenta molte sfide da superare (clearance muco-ciliare, bassi volumi di somministrazione, potenziale irritazione della mucosa nasale). L'obiettivo di questo lavoro di tesi è stato la progettazione, l'ottimizzazione, la preparazione e la caratterizzazione di nanoparticelle polimeriche (NPs) per la veicolazione IN di composti neuroattivi al cervello (sito target). I polimeri utilizzati sono stati selezionati per garantire il rilascio sostenuto dei composti neuroattivi sia a livello della mucosa nasale (via naso-sangue-cervello) sia a livello del liquido cerebrospinale (via naso-cervello, N2B), al fine di migliorare la biodisponibilità nel cervello dei farmaci selezionati: Diclofenac (DIC), Diclofenac epolamina (DIEP), clozapina (CZP) e carbamazepina (CBZ). In uno studio collaterale, sono state inoltre sviluppate e caratterizzate microparticelle polimeriche (MP) food-grade, adatte alla somministrazione orale, per la veicolazione di composti neuroattivi naturali (NNI), RL1 e RL2, utili nel trattamento dell'insonnia. Il polimero selezionato, oltre a essere "Generally Recognised as Safe" (GRAS) e ad aver ricevuto dall'EFSA la qualifica di prodotto alimentare, possiede proprietà gastroresistenti e può garantire un rilascio prolungato degli NNI nell'intestino tenue. Inoltre, la tecnica di preparazione utilizzata è facilmente scalabile e può essere applicata all'industria nutraceutica. L'articolo I (Lombardo et al. - Pharmaceutical Development and Technology, 2021) è una rassegna sui progressi delle nanotecnologie per la somministrazione di principi attivi (AI) attraverso la somministrazione IN. Questa rassegna si concentra sulla somministrazione IN descrivendo l'anatomia del naso, la BBB e le sue funzioni, il trasporto di farmaci dal naso al cervello e i vantaggi e gli svantaggi della somministrazione IN. Infine, riporta i progressi compiuti negli ultimi 10 anni dalle nanotecnologie relativi a sistemi di somministrazione IN di principi attivi, quali: microsfere, microparticelle mucoadesive (MP), microemulsioni, nanoparticelle polimeriche (NPs), NPs lipidiche solide (SLN), vettori lipidici nanostrutturati (NLC), NPs inorganiche, NPs proteiche virus-simili e auto-assemblanti (VLNP), dendrimeri, punti quantici (QDs), nanogel, nanoemulsioni (NEs) e liposomi. Nel lavoro II (Corsaro, Lombardo et al. - Applied Sciences, 2022) sono state sviluppate NPs polimeriche attraverso il metodo quasi-solvent evaporation emulsion (QESD) per la somministrazione IN di DIC e del suo sale di epolamina (DIEP). I farmaci sono stati incapsulati in una miscela di due polimeri, Eudragit® Retard RS100 e RL100, per garantire un rilascio sostenuto a livello della mucosa nasale e l'assorbimento del farmaco attraverso la mucosa per raggiungere il cervello (via naso-sangue-cervello). I lotti di NP ottimizzati sono stati caratterizzati per valutare il loro comportamento termotropico mediante calorimetria a scansione differenziale (DSC). Inoltre, questi polimeri sono stati selezionati per la loro carica cationica al fine di migliorare le proprietà mucoadesive delle NP, ideali per risiedere più a lungo nella cavità nasale e consentire un maggiore assorbimento del farmaco attraverso la mucosa nasale; sono state valutate le loro proprietà mucoadesive. Questo studio è stato condotto in vitro misurando la variazione del potenziale Zeta e il saggio turbidimetrico dopo l'incubazione delle NPs con la mucina nel fluido nasale simulato (SNF), rispetto alle sospensioni di farmaco puro. I risultati hanno mostrato che le NPs hanno mostrato forti interazioni con la mucina. La stabilità delle NP caricate con DIC e DIEP è stata valutata anche in SNF per prevedere potenziali fenomeni di aggregazione dopo la somministrazione nasale. Infine, gli esperimenti in vivo hanno dimostrato l'assenza di tossicità sulla mucosa nasale dei topi. Nel lavoro III (Lombardo et al. - Pharmaceutics, 2023) sono state formulate NPs polimeriche mucoadesive (miscela 1:1 di Eudragit® Retard, RS100 e RL100) per la somministrazione IN di clozapina (CZP). Le NPs hanno mostrato una dimensione di circa 400-500 nm, in grado di risiedere nella cavità nasale, dove il farmaco può essere rilasciato in modo prolungato e assorbito attraverso la mucosa nasale per raggiungere il cervello (via naso-sangue-cervello). Le NPs hanno mostrato un rilascio controllato di CZP fino a 8 ore. Inoltre, studi preliminari di mucoadesione in vitro hanno mostrato che le NPs presentavano già al tempo zero forti interazioni elettrostatiche con la mucina, dovute alla presenza della carica positiva dei copolimeri utilizzati. Per ridurre la clearance mucociliare, oltre alle proprietà mucoadesive, può essere utile la somministrazione di NPs in polvere. Questo sicuramente migliora anche la stabilità di conservazione della formulazione. Pertanto, la sospensione è stata liofilizzata utilizzando il 5% (w/v) di HP-β-CD come crioprotettore. Ciò ha garantito la conservazione delle dimensioni, del PDI e del potenziale zeta (ZP) delle NPs. Inoltre, sono stati condotti studi di caratterizzazione fisico-chimica delle NPs allo stato solido. Infine, sono stati eseguiti studi di tossicità in vitro su cellule MDCKII e cellule primarie di mucosa olfattiva umana e in vivo sulla mucosa nasale di topi CD-1. Questi ultimi hanno dimostrato la non tossicità delle NPs non caricate e lievi anomalie tissutali indotte dalle NP caricate con CZP. Nel lavoro IV (Bonaccorso et al. - Pharmaceutical Development and Technology, 2023) sono stati progettati e ottimizzati nanocristalli di carbamazepina (CBZ) per la somministrazione immediata e diretta di N2B. Le CBZ-NCs sono state preparate mediante tecnica solvent-antisolvent sonoprecipitation e la formulazione ottimizzata, attraverso l'approccio Quality by Design, ha mostrato una dimensione media di 291,2 nm ± 34,71 con una distribuzione quasi stretta (PDI ~ 0,4) e una carica neutra (ZP di -1,43 mV). La sospensione è stata convertita in polvere mediante processo di liofilizzazione, sotto crioprotezione con mannitolo al 5% (w/v). Gli studi di caratterizzazione sono stati condotti per valutare il comportamento termotropico, la cristallinità, la morfologia e il contenuto di farmaco. Studi preliminari di mucoadesione in vitro hanno mostrato una leggera interazione con la mucina (13,3% in 1 h e 6,6% in 24 h). Inoltre, gli studi di stabilità in vitro condotti nel fluido cerebrospinale artificiale (aCSF) non hanno mostrato alcuna aggregazione dei NCs. Infine, i NCs di CBZ non hanno mostrato segni di tossicità nelle cellule di ensheating olfattivo. Nel lavoro V (Lombardo et al., in corso) sono state sviluppate e ottimizzate NPs con due diversi polimeri, PLGA e PCL, per la somministrazione di CZP attraverso la via N2B. Le NPs sono state formulate con il metodo della deposizione con solvente e sono stati eseguiti studi di caratterizzazione allo stato solido, in vitro ed ex vivo per confrontare le diverse proprietà chimico-fisiche e biologiche delle PLGA-NPs e delle PCL-NPs. Le sospensioni ottenute sono state convertite nella formulazione finale in polvere, crioprotetta con il 5% (w/v) di D-maltosio per le PLGA-NPs e il 25% (w/v) di D-maltosio per le PCL-NPs. Le NPs hanno mostrato una dimensione di circa 200 nm, adatta alla ricaptazione dal nervo olfattivo per raggiungere direttamente il cervello, dove potrebbero rilasciare il farmaco. Gli studi di rilascio in vitro condotti in aCSF e SNF hanno dato i seguenti risultati: Le PLGA-NPs hanno rilasciato il 100% del farmaco in 4 giorni in SNF, mentre in aCSF hanno rilasciato circa l'80% in 20 giorni. Al contrario, PCL-NPs hanno rilasciato l'intera quantità di farmaco entro 24 ore in entrambi i fluidi. Inoltre, sono stati eseguiti studi preliminari di mucoadesione in vitro su NPs polimeriche in forma liquida (sospensioni) per confrontare la possibile variazione delle loro potenziali proprietà mucoadesive con quelle in polvere, che sono state testate direttamente sul tessuto della mucosa nasale di maiale, dove è stata valutata anche la permeabilità. Le NPs caricate con CZP hanno mostrato alcune interazioni con la mucina durante i test in vitro, ma non è stata dimostrata alcuna mucoadesività ex vivo. Inoltre, i risultati della permeazione indicano che l'uso di CZP-PCL-NPs non ha aumentato l'effettiva permeazione di CZP nella mucosa; sono stati comunque dimostrati un inizio più rapido della permeazione (20 minuti), rispetto a CZP libero (40 minuti), e un profilo controllato. Gli studi di tossicità sono stati condotti in vitro su cellule primarie della mucosa olfattiva umana estratte da pazienti volontari e su cellule MDCKII. Infine, sono stati condotti studi di stabilità per valutare le prestazioni delle NPs in varie condizioni di conservazione (sospensioni conservate a 4°C e 25°C per 3 mesi; polveri conservate a 25°C con il 50% di umidità relativa per 8 mesi) e in condizioni fisiologiche artificiali in SNF a 35°C e in aCSF a 37°C. I risultati hanno dimostrato l'assenza di fenomeni di aggregazione in aCSF e in SNF, mentre le NPs in polvere si sono rivelate più stabili. Il documento VI (Rizzo et al. - Journal of Physics: Conference Series, 2022) è un abstract esteso sui polimeri per uso alimentare e sul loro importante ruolo nei DDS a rilascio prolungato. Offre una panoramica sui polimeri approvati dall'EFSA e/o dalla FDA per le industrie alimentari e farmaceutiche. In particolare, i polimeri analizzati sono: alginato, chitosano, zeina, pectina, inulina, amido, etilcellulosa, gommalacca e gomme naturali, copolimeri Eudraguard®. Il documento VII (Rizzo et al. - Applied Sciences, 2023) è una rassegna sui progressi nei vettori alimentari costituiti da polimeri approvati dall'EFSA e/o dalla FDA per la somministrazione mirata di composti bioattivi al colon. I polimeri analizzati sono alginato, chitosano, zeina, pectine, inuline, gomma gommalacca, copolimeri Eudraguard® e gomme naturali. La rassegna si concentra sulla caratterizzazione tecnologica e sull'attività biologica (morfologia, dimensioni, carica superficiale, proprietà mucoadesive, efficienza di incapsulamento, comportamento termotropico, cristallinità, profili e cinetiche di rilascio, stabilità, citotossicità in vitro e in vivo, permeabilità in vitro, efficienza di targeting in vitro) di questi sistemi per valutarne efficacia, sicurezza e stabilità. Nel lavoro VIII (Lombardo et al., in corso) è stato utilizzato Eudraguard® Control (EUGC) come polimero food-grade per produrre una matrice di microcarrier caricata con due ingredienti neuroattivi naturali (NNI), utili nel trattamento dell'insonnia, per la somministrazione orale. L'EUGC è un copolimero di grado alimentare e generalmente riconosciuto sicuro (GRAS) negli Stati Uniti ed è autorizzato nell'UE (con il codice E1205) per applicazioni nutraceutiche. Questo polimero è stato selezionato principalmente per la sua capacità di per proteggere i principi attivi (AI) dal pH acido dello stomaco e per la sua capacità di garantire un rilascio lento e controllato a pH ≥ 6,8 (ambiente intestinale). Le MPs sono state preparate con il metodo dell'evaporazione del solvente, una tecnica facilmente scalabile nell'industria nutraceutica. Le formulazioni sono state preparate con diversi rapporti tra NNI e polimero (1:10 o 1:20) e le sospensioni sono state liofilizzate al fine di ottenere una polvere per la costituzione di future forme di dosaggio, come compresse, bustine, granuli o capsule. Per evitare fenomeni di aggregazione dovuti al processo di liofilizzazione, è stato aggiunto un agente disaggregante. Successivamente, sono stati condotti studi di caratterizzazione allo stato solido (comportamento termotropico, cristallinità, morfologia, resa produttiva, contenuto di farmaco, stabilità). Le polveri si sono dimostrate molto stabili se conservate per 11 mesi a 25°C con un'umidità relativa del 50%. Inoltre, sono stati eseguiti studi in vitro per valutare la cinetica di rilascio delle MPs e le potenziali proprietà mucoadesive: nel fluido gastrico simulato (SGF) le MPs non hanno mostrato interazioni con la mucina e il rilascio degli NNI incapsulati è stato minimo; al contrario, nel fluido intestinale simulato (SIF) le MPs hanno interagito con la mucina dopo 24 ore e il rilascio degli NNI è aumentato significativamente già dopo 30 minuti. Infine, è stato eseguito uno studio di tossicità in vitro su cellule MDCKII per confermare la biocompatibilità dei microcarrier.
Intranasal delivery, brain delivery, nanomedicine, polymeric systems., somministrazione intranasale, somministrazione al cervello, nanomedicina, sistemi polimerici.
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