Progettazione, sintesi e caratterizzazione di sistemi biomimetici e molecole ligandi di ioni metallici come agenti teranostici.

L'inibizione del processo di auto-aggregazione dei peptidi monomerici di amiloide-β (Aβ) è un approccio chiave nello sviluppo di farmaci per la malattia di Alzheimer (AD), in cui oligomeri a basso peso molecolare (LMW), solubili e altamente neurotossici, sono prodotti e aggregano nel cervello nel tempo. Inoltre, l’inclusione di un ligando fluorescente nello scaffold molecolare potrebbe potenzialmente consentire la visualizzazione in vivo di LMW tossici nei fluidi biologici, la previsione della progressione e la diagnosi differenziale, per poter finalmente personalizzare dosaggi di precisione. A tal proposito, il termine "theranostics" o "theranostic" è stato recentemente utilizzato per sintetizzare una nuova strategia in drug discovery in cui la diagnostica e la terapia diventano un singolo intervento. Per quanto riguarda la parte terapeutica per il trattamento dell'AD, scaffolds a base di peptidi, aventi nella propria struttura aggregation-prone sequenze di aminoacidi del peptide Aβ, è stato dimostrato impediscano/inibiscano l'auto-aggregazione di Aβ mediante legame specifico allo stesso segmento di Aβ. È come si trattasse di una competizione tra due molecole, una è la proteina/peptide nella forma nativa e l'altra è una parte più piccola di essa. Questo progetto di dottorato ha avuto come obiettivi lo sviluppo di un candidato agente teranostico e la valutazione della sua efficacia in vitro utilizzando modelli preclinici che mimano le condizioni fisiologiche a livelli di concentrazione molto bassi di peptidi Aβ. In particolare, lo scaffold molecolare (abbr. Zn-Porph) è costituito da un anello zinco-porfirinico fluorescente, covalentemente legato, tramite uno spacer peptidico di GPG, alla sequenza centrale idrofobica 16–20 (KLVFF) dei peptidi Aβ40 e Aβ42. L'effetto inibitorio sulla fibrillazione di Aβ42 è stato determinato mediante una varietà di tecniche spettroscopiche. In particolare, esperimenti di fluorescenza mediante ThT e i dati ottenuti mediante CD hanno mostrato che Zn-Porph impedisce la transizione conformazionale di Aβ42 in strutture ricche in foglietti β. Gli esperimenti MALDI-ToF-MS and NMR hanno fornito prove dirette che Zn-Porph forma un addotto supramolecolare con Aβ42 in forma monomerica. Questo è stato confermato dallo spettro di emissione di fluorescenza di Zn-Porph che ha mostrato un significativo quenching dovuto all’interazione con le specie Aβ42. Le misure di proteolisi-MALDI-ToF-MS e NMR hanno consentito l'identificazione dei siti d’interazione tra Zn-Porph e Aβ42. Il motivo KLVFF è il principale elemento di riconoscimento necessario per osservare l'interazione con la sequenza omologa in Aβ42, in sinergia con il coordinamento Zn (II) con i residui d’istidina nel peptide Aβ. L'attività neuroprotettiva di Zn-Porph è stata dimostrata utilizzando colture primarie di neuroni corticali o linee cellulari differenziate di neuroblastoma SH-SY5Y. Abbiamo inoltre affrontato la questione se Zn-Porph potesse anche inibire la formazione di LMW neurotossici del peptide Aβ40. Abbiamo ritenuto che l'uso di modelli in vitro del peptide Aβ40, più solubile e meno incline all'auto-aggregazione respetto Aβ42, potesse permetterci di seguire meglio in quale fase lo Zn-Porph potesse intervenire nel processo di oligomerizzazione nel tempo di acquisizione dei nostri esperimenti. Per la prima volta, abbiamo combinato l’electrospray ionization ion mobility mass spectrometry (ESI-IM-MS) (ESI-IM-MS) con l’analisi statistica multivariata (MVA) per confrontare i profili IM-MS di più campioni e per rivelare un sottoinsieme di specie statisticamente significative di Aβ40 la cui formazione è stata inibita nei campioni contenenti Zn-Porph. L'approccio IM-MS-MVA ha rivelato che la Zn-Porph altera la distribuzione di conformatori sia monomerici che dimeri di Aβ40 inibendone la formazione nella fase iniziale del percorso di aggregazione. Nonostante complessi Zn-Porph:Aβ40, con il monomero Aβ o il suo dimero, non sono stati osservati negli spettri ESI-IM-MS rispetto a quelli MALDI-ToF-MS, i nostri risultati suggeriscono fortemente che Zn-Porph previene efficacemente l’auto assemblaggio precoce di Aβ conducente agli oligomeri solubili e alle fibrille insolubili. Con l'aggiunta di Zn-Porph ad Aβ40 monomerico, le features corrispondenti alle sue forme monomeriche e alla conformazione dimerica compatta sono state, infatti, sostanzialmente eliminate, mentre quella corrispondente alla conformazione estesa ha mostrato una intensità significativamente ridotta. Ciò ha anche indicato che Zn-Porph forma un complesso con il conformero compatto del dimero, questo presumibilmente coinvolto in un processo di fibrillazione on-pathway, mentre quello esteso potrebbe essere coinvolto anche in un processo off-pathway conducente alla formazione di aggregati amorfi. È interessante notare che gli esperimenti IM-MS hanno rivelato nuovi segnali nei campioni contenenti Zn-Porph. La corrispondenza dei patterns MS/MS previsti utilizzando MS/MS database search programs con quelli delle nuove specie rilevate ha suggerito un'ossidazione catalizzata dalla porfirina in posizione Met-35 del peptide Aβ40. Ciò ha portato alla formazione di monomero Aβ40 Met-35(O) e dimero mono-ossidato costituito da un'unità di Aβ40Met-35 (O) e un'altra di Aβ40 non modificata. Sulla base dei risultati di cui sopra, abbiamo concluso che, legando e stabilizzando il monomero di Aβ40, con concomitante ossidazione catalizzata, potrebbe essere il meccanismo predominante di inibizione del processo di auto-aggregazione di Aβ da parte di questo candidato agente teranostico. La molecola fluorescente e multifunzionale studiata in questo progetto di dottorato mostra un potenziale promettente come agente teranostico per la diagnosi e la terapia dell'AD. Questa rimane la più grande sfida nella medicina personalizzata per l'AD. L'approccio statistico ottimizzato è innovativo nel campo dell'analisi basata sulla mobilità ionica del peptide Aβ e potrebbe rivelarsi utile anche in studi incentrati sull'inibizione in vitro dell’auto-aggregazione di Aβ42 e su altre malattie dovute a processo di aggregazione proteico/peptidico come Parkinson (PD) o sclerosi laterale amiotrofica (SLA) .

Grantor dc:publisher

Università degli studi di Catania

Year dc:date

2019

Author dc:creator

• LAZZARO, SERENA

Contributors dc:contributor

• VECCHIO, Graziella

• Alzheimer’s disease (AD), Amyloid β-peptide oligomers , Electrospray ionization-ion mobility-mass spectrometry (ESI-IM-MS) , Multivariate statistical analysis (MVA), Theranostic agent, Amyloid aggregation, Porphyrin derivative, Supramolecular recognition, Toxicity inhibition
• Malattia di Alzheimer (AD) , peptidi oligomerici di β-amiloide, Electrospray ionization-ion mobility-mass spectrometry (ESI-IM-MS) , Analisi statistica multivariata (MVA), Agente teranostico, Aggregazione amiloide, Derivato porfirinico, Riconoscimento supramolecolare, Inibizione tossicità

Statement dc:rights

• info:eu-repo/semantics/openAccess
• license:PUBBLICO - Pubblico con Copyright
• license uri:iris.PUB02

Language dc:language

ita

Handle dc:identifier

https://hdl.handle.net/20.500.11769/581971

OAI identifier oai:identifier

oai:www.iris.unict.it:20.500.11769/581971