Ruolo del lattato e della proteina Insulin-Like Growth Factor Binding Protein 6 nel Glioblastoma Multiforme

Il glioblastoma multiforme (GBM) è il tumore cerebrale primitivo più comune e più maligno del sistema nervoso centrale (SNC) negli adulti. Rappresenta la metà dei gliomi di nuova diagnosi e, nonostante il regime terapeutico aggressivo, la sopravvivenza mediana del paziente è di circa 14-17 mesi dopo la diagnosi. Il microambiente tumorale (TME) svolge un ruolo fondamentale nello stabilire la malignità ed è associato ad un elevato metabolismo glicolitico e ad una maggiore produzione di lattato, che si accumula nella TME attraverso trasportatori di monocarbossilati (MCT1-4) che modulano l'attività metabolica dei tessuti attraverso il trasporto accoppiato a protoni di monocarbossilati, in particolare L-lattato, corpi chetonici e piruvato. Tuttavia, il lattato può agire sia come metabolita che come molecola segnale attraverso l'attivazione del suo recettore GPR81, codificato dal gene HCAR1. Nella prima parte del progetto di dottorato, abbiamo studiato il ruolo del lattato nella progressione del GBM e nella riprogrammazione metabolica sia in vitro che in un modello in vivo. Lo studio in vitro è stato condotto su tre linee cellulari di glioblastoma umano trattate con lattato (20 mM) e acido 3,5-diidrossibenzoico (150 μM), un noto agonista farmacologico del recettore del lattato. Sono state valutate la proliferazione cellulare, la migrazione, la capacità di formazione di colonie e l'espressione di geni coinvolti nel metabolismo mitocondriale. Il metabolismo del lattato è stato valutato dall'espressione dei suoi trasportatori MCT1 e MCT4 e GRP81. I risultati sono stati convalidati in biopsie di GBM derivate dal paziente, confrontando l'espressione di MCT1 in campioni di GBM ad alto (H-) contro basso (L-) indice proliferativo (PI). Lo studio in vivo è stato condotto in un modello zebrafish di GBM e il fenotipo energetico è stato valutato mediante Seahorse XFp, l'espressione genica è stata valutata mediante sequenziamento NGS, analisi qPCR e immunofluorescenza. Gli effetti dell'esposizione al lattato di 20 mM sulla proliferazione dei tumori cerebrali in via di sviluppo sono stati valutati contando le cellule positive al fosfo-istone 3. I nostri risultati mostrano che il lattato ha aumentato significativamente la proliferazione cellulare, la migrazione e la capacità di formazione di colonie delle cellule GBM, sia in vitro che in vivo. Abbiamo anche scoperto che le cellule rispondono ad alti livelli di lattato extracellulare aumentando l'espressione del trasportatore MCT1 in tutte e tre le linee cellulari. In un modello Zebrafish di GBM, metabolismo alterato e maggiore espressione di MCT1 e GPR81 generano alti livelli di lattato extracellulare, che a sua volta supporta una maggiore proliferazione delle cellule tumorali. È interessante notare che la stimolazione con 3,5-DHBA è stata in grado di aumentare significativamente l'MCT1 in tutte le linee cellulari testate. Inoltre, i nostri risultati hanno mostrato che l'esposizione sia al lattato che al 3,5-DHBA ha indotto un aumento significativo dei livelli di espressione dei geni testati, confermando che il lattato è coinvolto nell'interruttore metabolico delle linee cellulari GMB. Infine, l'analisi immunoistochimica su biopsie GBM ha dimostrato che GBM ad alto PI ha mostrato un aumento significativo dei livelli di espressione di MCT1 e Ki67 rispetto a GBM a basso PI. Inoltre, è stata segnalata acidosi lattica in vari TME solidi incluso GBM. In particolare, nella TME sono state identificate diverse molecole segnale, fattori di crescita e metaboliti che sostengono la fuga immunitaria da GBM e inducono resistenza alla chemioterapia. Durante le prime fasi della malattia, le microglia si infiltrano nella TME contribuendo così alla tumorigenesi. Tra i vari fattori di crescita, è stato riportato che la proteina 6 legante il fattore di crescita insulino-simile (IGFBP6), un inibitore delle azioni dell'IGF-II, svolge un ruolo importante nella sopravvivenza e nella migrazione delle cellule tumorali, ma i suoi effetti sull'interazione tra tumore e sistema immunitario è ancora poco compreso. Pertanto, nella seconda parte del progetto di dottorato abbiamo studiato il crosstalk tra lattato e IGFBP6 nelle cellule microgliali e come tale interazione modula la progressione di TME e GBM. Abbiamo testato la nostra ipotesi in tre linee cellulari di glioblastoma umano (cioè U87-MG, A172 e U251) e una linea cellulare di microglia umana (HMC3) trattata con lattato (20 mM) e/o con IGFBP6 (400 ng/mL). La proliferazione cellulare, la migrazione e la capacità di formazione di colonie sono state valutate rispettivamente mediante la tecnologia Xcelligence, il test clonogenico e la guarigione delle ferite. Abbiamo anche valutato l'espressione dei livelli di mRNA di IGFBP6 delle cellule GBM e delle cellule della microglia trattate con lattato. Per confermare ulteriormente la possibile esistenza di un asse lattato-IGFBP6, abbiamo valutato l'effetto del lattato, dell'IGFBP6 e del mezzo condizionato delle cellule GBM pretrattate con IGFBP6 sulla microglia mediante analisi immunocitochimiche e RT-PCR per valutare un potenziale fenotipo antinfiammatorio M2 cambio. I nostri risultati hanno mostrato che la microglia esposta al lattato aumentava significativamente l'espressione dell'mRNA e delle proteine ​​di MCT1 e dei geni coinvolti nel metabolismo mitocondriale. Abbiamo anche mostrato un aumento del marker M2, Arg-1, e una riduzione di iNOS indicativa di uno stato proinfiammatorio M1. Inoltre, il trattamento con lattato nelle cellule della microglia ha indotto un aumento significativo dell'espressione di IGFBP6. Coerentemente, le cellule GBM trattate con IGFBP6 hanno mostrato un aumento significativo della proliferazione cellulare, della migrazione e della formazione di colonie. È interessante notare che i nostri dati hanno mostrato che il trattamento con IGFBP6 ha comportato anche un aumento del marker M2, Arg-1 e una riduzione dei livelli di espressione di iNOS. Questi risultati sono stati ulteriormente confermati valutando l'espressione dei livelli di mRNA dei marcatori M1 e M2 su cellule di microglia coltivate con terreni condizionati da cellule GBM pretrattate con IGFBP6. Infine, i nostri risultati sono stati ulteriormente confermati dalle biopsie GBM derivate dal paziente e dall'analisi del trascrittoma. In conclusione, i nostri risultati suggeriscono che il lattato e il suo trasportatore (MCT1) e recettore (GPR81) svolgono un ruolo importante nella proliferazione e migrazione del GBM e possono rappresentare un potenziale bersaglio per sviluppare nuove strategie per contrastare la progressione e le recidive del tumore e che non vi è un crosstalk lattato/IGFBP6 nelle cellule microgliali e che questa relazione modula la TME influenzando la progressione del tumore e la resistenza alla terapia.

Grantor dc:publisher

Università degli studi di Catania

Year dc:date

2021

Author dc:creator

• LONGHITANO, LUCIA

Contributors dc:contributor

• LI VOLTI, Giovanni

• Lactate, IGFBP6, Microglia, Tumor Microenvironment, Glioblastoma Multiforme
• Lattato, IGFBP6, Microglia, Microambiente Tumorale, Glioblastoma Multiforme

Statement dc:rights

• info:eu-repo/semantics/openAccess
• license:PUBBLICO - Pubblico con Copyright
• license uri:iris.PUB02

Language dc:language

ita

Handle dc:identifier

https://hdl.handle.net/20.500.11769/581897

OAI identifier oai:identifier

oai:www.iris.unict.it:20.500.11769/581897