Nanoparticelle di biossido di titanio: tossicità e possibile ruolo come interferenti endocrini

Negli ultimi decenni, i paesi in via di sviluppo hanno registrato una riduzione dei parametri riproduttivi maschili, come la qualità del seme e la funzione delle cellule di Leydig. Nel 20% delle coppie infertili il fattore maschile è la principale causa di infertilità. È noto che l’incremento dell’infertilità maschile sia dovuta all’esposizione a xenobiotici con attività ormonale chiamati interferenti endocrini (IE). Essi possono influenzare il sistema ormonale dell’uomo e degli animali, compromettendo così lo sviluppo, la riproduzione e la salute. Sebbene sia ben nota l’attività di “interferenti endocrini classici” quali: pesticidi, insetticidi, inquinanti organici persistenti (POP), sostanze chimiche perfluorurate (PFC), policlorobifenili (PCB), ftalati, bisfenolo A (BPA) e metalli pesanti; è necessario includere tra le sostanze esogene presenti nell’ambiente anche i nanomateriali e in particolare le nanoparticelle (NP). L’introduzione e l’uso di materiali su scala nanometrica, sta cambiando il nostro modo di vivere, portando ad una nuova rivoluzione che può essere definita “Nano Revolution”. Le nanoparticelle vengono applicati in vari settori come l'elettronica, la biomedicina, i prodotti farmaceutici, i cosmetici e l’industria alimentare quindi un loro rilascio a livello ambientale può determinare un’esposizione continua e involontaria per gli esseri viventi, uomo compreso. Le NP grazie alle loro dimensioni estremamente ridotte (1-100 nm) sono molto più assorbibili dagli organismi viventi; di conseguenza possono attraversare il sistema circolatorio e quindi essere distribuiti in vari organi compresi quelli riproduttivi. Non è quindi da escludere una possibile attività endocrina da parte delle NPs. Le nanoparticelle di ossido di metallo (MONPs), sono la categoria di nanoparticelle più versatili che trovano diverse applicazioni, e tra esse sono intensamente utilizzate le nanoparticelle di biossido di titanio (TiO2-NPs). Lo scopo della mia tesi è stato valutare il possibile effetto tossico delle nanoparticelle di biossido di titanio (TiO2-NPs), in qualità di interferenti endocrini sul sistema riproduttivo maschile tramite esperimenti in vivo ad in vitro; inoltre, è stato valutato anche il loro effetto tossico sullo sviluppo embrionale. TiO2-NPs commerciali (P25, Degussa) sono state testate alle concentrazioni di 1mg/L, 2mg/L e 4 mg/L sugli embrioni di Danio rerio tramite ZFET (test di tossicità acuta su embrioni di zebrafish) e sugli adulti maschi tramite un test di tossicità cronica della durata di 30 giorni. Nelle larve di zebrafish al termine dell’esposizione sono stati valutati biomarker dello stress ossidativo quali Poly ADP-Ribose Polymerase-1 (PARP-1) e Heat Shock Protein-70 (Hsp70), e i biomarker Sex hormone-binding globulin (SHBG), Prothymosin-α (PTMA) che suggeriscono l’azione delle TiO2-NPs come interferenti endocrini. Per tutto il periodo dell’esposizione sono stati valutati i tassi di uova coagulate e schiuse, e cambiamenti nel fenotipo delle larve come la lunghezza della larva; infine, è stata valutata anche la frequenza cardiaca tramite il software DanioScope. Negli adulti maschi, è stato esaminato l’effetto delle TiO2-NPs sulle gonade quindi sono state valutate tutte le alterazioni isto-morfologiche della gonade e tramite indagini d’immunofluorescenza sono stati valutati i biomarker Sex hormone-binding globulin (SHBG) e P540 Aromatase (P540), inoltre tramite qRT-PCR è stata valutata l’espressione dei geni SHBG, SRD5A2, SOD2 and GPX4B. Infine, l’effetto delle TiO2-NPs è stato valutato sulle cellule spermatiche umane tramite esperimenti in vitro. Sono state testate le concentrazioni di TiO2-NPs pari a 50 ppm, 100ppm, 250 ppm e 500 ppm che corrispondono a quelle che potrebbero rivestire una capsula di farmaco, dato che non esiste una regolamentazione per la quantità di TiO2-NPs usata come additivo nei farmaci. È stato utilizzato uno swim-up da pellet per incubare le cellule spermatiche con le soluzioni di TiO2-NPs, per un tempo totale di 1 ora. Al termine dell’incubazioni sono stati valutati i seguenti parametri spermatici: motilità, vitalità, frammentazione del DNA tramite Halosperm e saggio TUNNEL, valutazione intracellulare dei ROS tramite MiOXSYS e valutazione dei biomarker Heat Shock Protein-70 (Hsp70), Sex hormone-binding globulin (SHBG) e Metallothionein (MT). Infine, la localizzazione delle TiO2-NPs sulle cellule spermatiche è stata valutata tramite microscopia elettronica a scansione. I risultati ottenuti hanno dimostrato che le TiO2-NPs non alterano lo sviluppo embrionale di Danio rerio, gli embrioni esposti a tutte le concentrazioni di TiO2-NPs (1mg/L, 2mg/L and 4 mg/L) completavano lo sviluppo embrione, e il loro tasso di schiusa era maggiore rispetto ai controllo ( p< 0,05). Gli embrioni esposti non mostravano malformazioni spiccate; tuttavia, è stata evidenziata una diminuzione nella lunghezza del corpo e un aumento delle frequenza cardiaca (BPM) maggiore nel gruppo 4mg/L rispetto al controllo e agli altri gruppi esposti (p< 0,05). I biomarker valutati hanno dimostrato che le TiO2-NPs inducevano stress ossidativo come dimostrato dalla positività ai biomarker PARP-1, Hsp70. Inoltre, una positività al biomarker SHBG è stata osservata a livello della testa della larva, con un’intensità maggiore per la concentrazione 4mg/L; invece, il biomarker PTMA evidenziava una positività in tutto il corpo della larva. Nelle gonadi degli adulti, le TiO2-NPs hanno causato un’alterazione nell’organizzazione morfologica/strutturale della gonade con evidente distacco tra l’epitelio seminifero e la membrana basale su cui fisiologicamente poggia. Per la concentrazione 4mg/L è stato anche osservata una disorganizzazione dei tubuli testicolare. L’indagine strutturale tramite microscopia elettronica a trasmissione ha inoltre evidenziato la presenza di vacuoli e la necrosi delle cellule del Sertoli. L’indagine d’immunofluorescenza ha mostrato una positività per il biomarker SHBG soprattutto a livello delle cellule del Leydig e lo stesso è stato osservato per il biomarker P540. I risultati delle qRT-PCR hanno mostrato un aumento dell’espressione genica dei geni coinvolti nello stress ossidativo e anche del gene responsabile della conversione del testosterone in diidrotestosterone. Poichè le celle del Leydig sono principalmente coinvolte in questa attività, un aumento dell’attività genica si può spiegare con la capacità delle TiO2-NPs di agire come interferenti endocrini e quindi con attività androgenica. A livello delle cellule spermatiche, non è stato osservata una diminuzione delle motilità e vitalità spermatica, invece è incrementata la frammentazione del DNA spermatico dovuta all’attività ossidante delle TiO2-NPs come dimostrato dall’aumento del valore di ORP, per la concentrazione di 500ppm (ORP: 206,7 mV), ottenuto tramite MiOXSYS e dalla positività osservata per le Hsp70. Una positività a livello del collo dello spermatozoo è stata osservata anche per il biomarker SHBG. Complessivamente, la nostra indagine conferma che TiO2-NPs hanno la capacità di indurre stress ossidativo sia durante lo sviluppo embrionale, sia a livello della gonade maschile e delle cellule spermatiche umane. Ciò comporta inevitabilmente un’alterazione del contenuto di ROS con conseguenze sul normale funzionamento cellulare. Nelle gonade maschile, l’aumento di ROS ha effetti sulla normale spermatogenesi, invece nelle cellule spermatiche è causa di danno al DNA con insuccesso nella fecondazione. Inoltre, non è da escludere l’attività simil-androgenica delle TiO2-NPs. Dunque, i risultati ottenuti possono contribuire ad aumentare le conoscenze sulla tossicità delle TiO2-NPs, i cui dati presenti in letteratura si concentrano principalmente sullo sviluppo embrionale e poco sul sistema riproduttivo; inoltre, tali risultati possono essere traslasti sull’uomo così da incrementare le conoscenze sull’infertilità maschile.

Grantor dc:publisher

Università degli studi di Catania

Year dc:date

2022

Author dc:creator

• SCALISI, ELENA MARIA

Contributors dc:contributor

• DI STEFANO, Agata

• nanoparticles, endocrine disruptors, infertility, Danio rerio, human sperm cell, embryonic development, male organs
• nanoparticelle, interferenti endocrini, infertilità, Danio rerio, spermatozoi umani, sviluppo embrionale, organi maschili

Statement dc:rights

• info:eu-repo/semantics/openAccess
• license:PUBBLICO - Pubblico con Copyright
• license uri:iris.PUB02

Language dc:language

ita

Handle dc:identifier

https://hdl.handle.net/20.500.11769/581381

OAI identifier oai:identifier

oai:www.iris.unict.it:20.500.11769/581381