Prevenzione secondaria del mesotelioma pleurico maligno in popolazione esposta a fibre asbestiformi: identificazione di biomarkers molecolari e proteici

Il comune di Biancavilla (Catania, Sicilia) è stato riconosciuto Sito di Interesse Nazionale (SIN) dal DM 468/2001 il cui perimetro è stato approvato dal DM 231/2002. Il Decreto fa riferimento alla presenza di una cava di materiale lapideo contaminato da una fibra asbestiforme denominata fluoro-edenite (FE). Si configura quindi un'esposizione ambientale per la popolazione generale poiché dal 1950 al 1998 le case e le strade di Biancavilla sono state realizzate con materiali provenienti dalla predetta cava. In relazione a tale esposizione, nel comune di Biancavilla è stato riscontrato un cluster di mesotelioma pleurico maligno (MPM), che ha portato la popolazione scientifica a condurre studi in vivo e in vitro sull'FE. Questi studi hanno dimostrato la cancerogenicità del FE, classificato dall'Agenzia Internazionale per la Ricerca sul Cancro (IARC) come sicuramente cancerogeno per l'uomo (Gruppo 1). L'MPM è un tumore insidioso e letale, caratterizzato da lunga latenza e sintomi aspecifici, che causano una diagnosi tardiva, ed è molto invasivo per il paziente. L'MPM è causalmente correlato all'esposizione all'amianto. I casi di MPM nel mondo sono in aumento. In Italia si stima un picco di incidenza tra il 2015 e il 2025 dovuto all'ubiquità e all'eccezionale persistenza del materiale nell'ambiente. Attualmente, il 25% degli MPM deriva da esposizione professionale, il 25% da esposizione indiretta del familiare e il 50% da esposizione a fibre presenti nell'ambiente. L'inalazione di fibre asbestiformi e il loro accumulo nel polmone innesca una serie di effetti sugli organi biomolecolari tra cui la produzione di specie reattive dell'ossigeno (ROS), il danno cromosomico, l'alterazione del processo mitotico, i segnali dei fattori di crescita e la cascata apoptotica, le mutazioni genetiche, la deregolazione dello stato di metilazione, infiammazione cronica, espressione aberrante di microRNA (miRNA). Attualmente non esiste una cura per l'MPM e la diagnosi precoce potrebbe migliorare sia la prognosi che il monitoraggio della risposta terapeutica. I segni clinici e di imaging dell'MPM non sono specifici; e una diagnosi definitiva, che si basa sull'istologia, a volte può essere molto difficile da ottenere, anche con l'uso dell'immunoistochimica. Ad oggi, nessun singolo marcatore o pannello di biomarcatori solubili è disponibile per una chiara diagnosi di MPM, quindi l'identificazione di biomarcatori specifici, sensibili e minimamente invasivi per MPM è in corso da anni con risultati incoraggianti ma non definitivi per la prevenzione di MPM. Negli ultimi anni diversi studi hanno indagato un gran numero di miRNA, biomarcatori con valore diagnostico già riconosciuto per diversi tipi di carcinoma, cercando una correlazione con l'MPM, in particolare queste ricerche erano finalizzate a dimostrare una possibile correlazione tra l'espressione di miRNA, tipo di cancro e grado di differenziazione del cancro. I miRNA sono molecole di RNA non codificanti altamente conservate, lunghe circa 20-25 nucleotidi, che svolgono un importante ruolo regolatorio a livello post-trascrizionale. In virtù della loro attività post-trascrizionale, sono stati identificati come nuovi potenziali biomarcatori, legati al grado di differenziazione cellulare, e quindi correlati al tipo e allo stadio di MPM. I miRNA circolanti sono considerati biomarcatori diagnostici per varie condizioni fisiopatologiche come tumori, malattie neurodegenerative, diabete e altre patologie. I MiRNA possiedono tutte le caratteristiche del marker ideale e forniscono indicazioni affidabili prima dell'insorgenza dei sintomi clinici (diagnosi precoce), sono sensibili ai cambiamenti della patologia (evoluzione della patologia o risposta terapeutica), sono facilmente rilevabili dai fluidi (sangue, urina, saliva) come biopsia liquida e sono facilmente trasferibili dai modelli di laboratorio all'uomo. I miRNA sono biomarcatori particolarmente interessanti in quanto la loro breve sequenza nucleotidica rimane stabile, rendendo queste molecole eccellenti candidati per l'estrazione e la quantificazione a partire da tessuto e sangue intero fissati in formalina e inclusi in paraffina (FFPE). Su queste basi, lo scopo dello studio è stato quello di identificare e validare un pannello di biomarcatori molecolari (miRNA) e proteine ​​in relazione ai cambiamenti indotti sulla pleura, in soggetti esposti a fibre FE al fine di fornire uno strumento di screening minimamente invasivo per prevenzione secondaria a MPM in una popolazione ad alto rischio di incidenza e mortalità. A tal fine, le analisi in silico sono state eseguite dapprima su soggetti sani/esposti con fibre di amianto rispetto a pazienti con MPM utilizzando lo strumento GEO2R disponibile su GEO DataSets. Queste analisi hanno rivelato una serie di miRNA strettamente coinvolti nell'MPM unendo gli elenchi di miRNA trovati espressi in modo differenziale nei set di dati di espressione di miRNA contenuti nel database GEO DataSets. I tre miRNA selezionati come statisticamente significativi erano hsa-miR-323a-3p, hsa-miR-101–3p e hsa-miR-20b-5p. In secondo luogo, sono stati eseguiti esperimenti funzionali in vitro sulla normale linea cellulare mesoteliale pleurica (MeT-5A) e sulla linea cellulare MPM (JU77) per testare gli effetti cancerogeni e la modulazione epigenetica indotta dall'esposizione a FE. Il risultato delle valutazioni computazionali ha consentito l'analisi dei livelli di espressione dei miRNA precedentemente identificati in silico sia in vitro che in MPM rispetto ai tessuti FFPE della pleura non maligna per valutare le differenze nei livelli di espressione dei miRNA selezionati e il loro potenziale diagnostico e prognostico MPM . Per amplificare i miRNA precedentemente identificati in silico sia in vitro che in campioni FFPE è stato utilizzato un test PCR digitale a goccia personalizzato (ddPCR). Successivamente, consultando il Catalogue of Somatic Mutation In Cancer (COSMIC) è stato possibile identificare i 20 geni più mutati noti per essere coinvolti nello sviluppo di MPM e quindi avere un'espressione disregolata. Inoltre, l'implicazione clinica dei miRNA analizzati è stata valutata attraverso i dati clinico-patologici e l'analisi dei profili di espressione dei miRNA contenuti nel database The Cancer Genome Atlas Mesotelioma (TCGA-MESO) e scaricati utilizzando lo strumento di esplorazione online UCSC Xena Browser. Inoltre, utilizzando lo strumento di previsione bioinformatica microRNA Data Integration Portal (mirDIP) sono stati valutati i livelli di interazione tra i miRNA precedentemente identificati tramite l'analisi computazionale ei principali geni mutati e alterati in MPM. I dati in vitro hanno mostrato coerenza tra i livelli di espressione di hsa-miR-323a 3p e hsa-miR-101–3p e i risultati in silico (rispettivamente up-regulation e down-regulation nei casi di MPM rispetto ai controlli). Invece, hsa-miR-20b-5p ha mostrato un aumento non significativo dose-dipendente della linea cellulare MeT-5A, ma una significativa sovraregolazione nelle cellule JU77 rispetto al controllo e al MeT-5A trattato, in contrasto con l'analisi in silico che ha mostrato una downregulation nei casi di MPM rispetto ai controlli. I dati ex vivo hanno mostrato una diversa espressione dei tre miRNA analizzati in MPM e controlli sani. È stata osservata una tendenza statisticamente significativa di down-regulation per hsa-miR-323a-3p, hsa-miR-101-3p e hsa-miR-20b-5p nei casi di MPM rispetto ai controlli. Inoltre, hsa-miR-101-3p ha mostrato un valore prognostico per MPM perché l'analisi dei livelli di espressione dei miRNA considerando la sopravvivenza globale mediana (OS), la sopravvivenza specifica della malattia (DSS) e l'intervallo libero da progressione (PFI) contenuti nel database TCGA-MESO ha rivelato un'associazione significativa tra alti livelli di espressione di hsa-miR-101-3p e aumento del sistema operativo. Secondo l'analisi del target del gene mirDIP, questi tre miRNA possono indirizzare e modulare sia i geni oncosoppressori che quelli oncogeni che svolgono un ruolo potenzialmente chiave nello sviluppo delle cellule tumorali. Con questo lavoro di ricerca, vorremmo contribuire alla ricerca di base sui biomarcatori e speriamo di trasferire questi risultati alla pratica clinica per l'identificazione delle alterazioni cellulari del cancro in una fase iniziale.

Grantor dc:publisher

Università degli studi di Catania

Year dc:date

2022

Author dc:creator

• FILETTI, VERONICA

Contributors dc:contributor

• STEFANI, Stefania

Statement dc:rights

• info:eu-repo/semantics/openAccess
• license:PUBBLICO - Pubblico con Copyright
• license uri:iris.PUB02

Language dc:language

ita

Handle dc:identifier

https://hdl.handle.net/20.500.11769/581369

OAI identifier oai:identifier

oai:www.iris.unict.it:20.500.11769/581369