Plasmonic Detection of microRNA Biomarkers in Microfluidic Devices for Brain Cancer Non-Invasive Diagnosis
I gliomi sono tumori cerebrali aggressivi che causano un tasso di sopravvivenza molto basso per i pazienti, anche dopo la diagnosi. Lo sviluppo di una tecnica diagnostica affidabile, economica e non invasiva con effetti collaterali minimi, è una delle principali sfide mediche e sociali dell'UE. La biopsia liquida ha guadagnato molta attenzione per il rilevamento e caratterizzazione di biomarcatori circolanti, come microRNA circolanti, i cui livelli di espressione possono essere correlati a una significativa varietà di malattie. Gli svantaggi dei metodi convenzionali di rilevamento dei microRNA possono essere superati applicando la tecnologia delle piattaforme di biosensori. In particolare, i biosensori di risonanza plasmonica di superficie per immagini (SPRi, dal suo acronimo in inglese) consentono un rilevamento rapido, altamente sensibile e selettivo dei microRNA in tempo reale, senza la necessità di etichette. Questa tesi di dottorato ha come scopo la rilevazione plasmonica di biomarcatori microRNA in dispositivi microfluidici per la diagnosi non invasiva del cancro al cervello. È stato implementato un test di rilevamento di microRNA, selezionando una sonda di superficie di acido nucleico peptidico (PNA, dal suo acronimo in inglese) a carica neutra e complementare per legare microRNA. L'immobilizzazione superficiale di queste sonde di PNA e l'ibridazione del microRNA obiettivo sono state notevolmente migliorate aggiungendo ioni di magnesio al buffer, depositando una carica positiva sulla superficie del sensore, facilitando l'attrazione di microRNA con carica negativa sulla superficie del sensore. Un ampio studio sulla curva di fusione ha confermato questa ipotesi e ha escluso una stabilizzazione duplex di PNA e microRNA in soluzione (risultati in accordo con la letteratura che riporta le interazioni indipendenti dalla forza ionica). Inoltre, è stato realizzato un rilevamento ultrasensibile di microRNA in campioni di pool di siero umano e pazienti con glioma. Per il miglioramento del segnale, è stato implementato un test potenziato con nanoparticelle d'oro per rilevare le concentrazioni di microRNA nel siero umano nell'intervallo femtomolare. Infine, la polimerizzazione isotermica a spostamento del filamento circolare (ICSDP, dal suo acronimo in inglese) è stato studiato per consentire l'amplificazione senza PCR di obiettivo a basse concentrazioni. Dopo uno studio riuscito della verifica teorica in soluzione, il test è stato trasferito alla piattaforma di biosensori SPRi, dove sono state studiate diverse sostanze chimiche di superficie. Anche se la fase di amplificazione non ha avuto successo, questo lavoro fornisce una base essenziale per ulteriori studi.
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