Aplicación de polen de abeja como activador en el proceso de fermentación alcohólica
Los activadores de fermentación son productos enológicos que se están empleando para la mejora de las condiciones de crecimiento y disminución del estrés de las levaduras durante la fermentación alcohólica. Los elevados grados alcohólicos potenciales, el déficit en nitrógeno fácilmente asimilable de los mostos, la necesidad de implantar con rapidez los pies de cuba, la presencia de sustancias tóxicas inhibidoras del crecimiento de las levaduras y los riesgos de aparición del fenómeno de reducción son algunos de los argumentos que justifican el uso de activadores fermentativos. La mayoría de ellos responden, hasta el momento, a formulaciones químicas con una base importante de nitrógeno amoniacal (fosfato amónico), ácidos grasos insaturados y vitaminas (tiamina). Algunos contienen polvo de celulosa y/o autolisados de levaduras que adsorben sustancias tóxicas inhibidoras del medio. Sin embargo, en esta amplia lista no existe ningún producto natural que pueda contener una formulación óptima capaz de dar respuesta integral a todas las necesidades previstas durante la fermentación alcohólica, entre las que cabría destacar la activación al inicio de la fermentación, el aumento de la supervivencia de las levaduras al final del proceso y la mejora de la producción de compuestos aromáticos, minimizando la aparición de defectos olfativos. Las nuevas tendencias de mercado orientadas a la utilización de productos de origen natural, muy poco procesados y que respeten el medioambiente, da sentido al presente proyecto de tesis, en el cual, se propone el uso del polen de abeja como activador-nutriente natural en la fermentación alcohólica. Esta Tesis Doctoral, se ha financiado dentro del Plan Propio de Investigación de la Universidad de Cádiz (2013-023/PU/EPIF-FPI-CT/CP), con el título “Aplicación de polen de abeja como activador en el proceso de fermentación alcohólica”. La investigación tiene como objetivo principal estudiar tanto la viabilidad, como los efectos positivos y negativos producidos por el uso del polen de abeja en la vinificación en blanco y en tinto. La metodología de trabajo se ha desarrollado a escala laboratorio-piloto. En una primera fase se analizaron los efectos de diferentes dosis de polen, tanto en la vinificación en blanco como en tinto. Posteriormente, en una segunda fase, se validó el uso del polen frente a otros activadores comerciales. Para cumplir con los objetivos marcados, se han llevado a cabo la vinificación en blanco de las variedades Palomino fino y Riesling, y la vinificación en tinto de la variedad Tintilla de Rota. La aplicación del polen fue realizada directamente sobre los mostos blancos desfangados o sobre la vendimia tinta despalillada y molturada antes de la fermentación alcohólica. Para todas las variedades se emplearon diferentes dosis de polen (0,1, 0,25, 1, 5, 10 y 20 g/L) de acuerdo con estudios preliminares del equipo investigador. En primer lugar, se estudió si el polen en sus diferentes dosis tenía algún tipo de efecto sobre la composición fisicoquímica de los mostos blancos y tintos. Los resultados mostraron que la adición de polen conlleva a un aumento significativo de los niveles de nitrógeno fácilmente asimilable (NFA) en los mostos blancos y tintos, estableciéndose una correlación lineal con la dosis de polen. Asimismo, los resultados no mostraron cambios significativos en la densidad, salvo para las dosis más altas (10 y 20 g/L), donde posiblemente hay una cierta aportación de azúcar, tal como se había observado en estudios preliminares con hidromiel. El resto de parámetros no se vieron alterados, salvo un ligero incremento en la acidez total, en el caso de los mostos de Tintilla de Rota con la dosis más alta de polen, aunque en todos los casos, el pH se mantuvo constante. En segundo lugar, se llevó a cabo la fermentación alcohólica de los mostos blancos y el encubado de los tintos. Para el inicio de la fermentación se emplearon inóculos de levaduras secas activas (LSA) y una temperatura controlada de 19⁰C. Durante la fermentación alcohólica, se realizó un seguimiento de la densidad, del NFA, y la biomasa viable (levaduras). Los resultados de las medidas de densidad y de biomasa mostraron en todos los casos, que con la presencia de polen se mejoraba la cinética fermentativa y la capacidad de reproducción de las levaduras durante la fase exponencial de crecimiento. La evolución del NFA mostró que el polen es capaz de mantener e incluso aumentar los niveles de NFA durante la fermentación, sobre todo a dosis altas, ya que actúa como fuente de reserva que se va liberando posiblemente gracias a la acción solubilizante del alcohol. Como consecuencia de ello, los vinos finales elaborados con las dosis altas de polen presentaron contenidos residuales de NFA muy altos, pudiendo ser de interés para el desarrollo de otros procesos biológicos como la crianza biológica o la fermentación maloláctica, o bien una causa de riesgo ante posibles desarrollos microbianos no deseados. En tercer lugar, una vez finalizada la fermentación alcohólica, los vinos blancos se clarificaron y estabilizaron por frío antes de ser filtrados, para luego ser embotellados con presencia de atmósfera inerte (N2) antes de su caracterización físico-química y sensorial. Los resultados de la caracterización físico-química indicaron que el polen no afecta de manera significativa al contenido en etanol, acidez volátil y pH, incluso a las dosis más altas. Sin embargo, en relación a los parámetros de color, se observó un desplazamiento hacia los tonos anaranjados y un incremento de la intensidad colorante, sobre todo a partir de la dosis de 1 g/L, posiblemente provocados por el aporte de compuestos polifenólicos y pigmentos del polen. En el caso de los vinos tintos, terminada la fermentación alcohólica, se descubaron por decantación y se trasvasaron a recipientes limpios e inertes, para el desarrollo de la fermentación maloláctica. Para esta segunda fermentación, se utilizó un inóculo de bacterias ácido lácticas Oenoccous oeni (Laffort, Burdeos, Francia). La fermentación maloláctica se controló mediante la cuantificación del ácido málico. Los resultados mostraron un aumento de la velocidad de consumo de este sustrato con la dosis de polen, observándose así una influencia positiva del polen sobre las bacterias lácticas. Una vez finalizado el proceso, los vinos fueron decantados en frío y los vinos limpios se embotellaron con atmósfera inerte (N2) para evitar alteraciones hasta su caracterización fisicoquímica. Los resultados mostraron que el polen, en las dosis empleadas, no afectaba a ninguno de los parámetros fisicoquímicos analizados, incluyendo los parámetros cromáticos y los pigmentos. En cuarto lugar, mediante cromatografía de gases se analizaron y se caracterizaron los compuestos volátiles minoritarios (CG-GM) y mayoritarios (CG) de los vinos finales. Los resultados mostraron de forma general que la adición de polen produce un aumento en los compuestos volátiles totales, tanto en los vinos blancos como en los tintos, aunque los comportamientos de las familias de compuestos fueron algo diferentes en ambos tipos de vinos. En Palomino fino, los mayores incrementos se produjeron a las dosis altas de polen (10 y 20 g/L), mientras que en Riesling y Tintilla este efecto se produjo a dosis bajas (0,1, 0,25 g/L) fundamentalmente. En los vinos tintos, la producción de compuestos volátiles totales con el polen no fue tan importante posiblemente porque fueron atenuados por la presencia de los hollejos durante la fermentación alcohólica. Los cálculos de los valores de la actividad odorante (VAO), mostraron que las dosis bajas, en todos los casos, obtuvieron los mayores valores en las series odorantes positivas (frutas y flores), mientras que con las dosis altas se obtuvieron los valores más elevados en las series odorantes negativas (grasa, herbáceo, frutos secos). En quinto lugar, se realizó un análisis sensorial descriptivo de todos los vinos por parte de un panel de cata. Por un lado, se analizaron los atributos organolépticos generales (carácter frutal, floral, especiado, en nariz; dulzor, acidez, amargor, astringencia, salinidad, cuerpo y persistencia, en boca) y por otro, los atributos olfativos específicos para vinos blancos y los específicos para vinos tintos. Los resultados corroboraron lo observado en los VAO. Los vinos blancos y tintos elaborados con dosis bajas de polen mostraron los valores más altos en las notas a frutas y flores, siendo estos atributos los más influyentes en las notas de cata. Mientras que, con las dosis altas, en los vinos blancos se intensificaron los olores más vegetales, a cereal y a polen, y en los vinos tintos, las frutas se tornaron más maduras y/o pasificadas. Como resultado final se estableció que la dosis de polen que había producido una mejora en la calidad sensorial de los vinos blancos y tintos fue 0,25 g/L. Con esta dosis de polen, se consiguieron buenos resultados sobre la cinética fermentativa y sobre el perfil aromático de los vinos, sin producir ninguna alteración en los parámetros físico-químicos y de color de los vinos finales. En sexto lugar, y con objeto de validar el polen frente a otros activadores comerciales, se volvieron a realizar las vinificaciones con las mismas variedades de uva (Palomino fino, Riesling y Tintilla de Rota), comparando el uso de la dosis seleccionada de polen de abeja frente a la misma dosis de un activador comercial (Laffort, Burdeos, Francia). Inicialmente se estudió el efecto sobre el NFA, y en ese sentido los resultados mostraron que tanto el polen como el activador comercial aumentaban en la misma proporción los niveles de NFA iniciales del mosto. En relación a la cinética fermentativa, en la mayoría de los casos, los vinos con polen experimentaron mejoras en comparación con el activador comercial y con los vinos testigo. De la misma forma, los vinos con polen fueron los que presentaron los mayores incrementos en las poblaciones de levaduras. En todos los casos, la evolución del contenido en NFA mostró de nuevo que el polen puede liberar NFA, a diferencia del activador, durante la fermentación alcohólica. Con los vinos finales se trabajó de igual forma al estudio con diferentes dosis. Los vinos tintos descubados fueron inoculados usando un pie de cuba de bacterias lácticas comerciales y una vez se inició la fermentación maloláctica, su evolución fue controlada haciendo el seguimiento del contenido en ácido málico. En todos los casos, los resultados mostraron de nuevo que el polen ejerce una influencia positiva sobre la fermentación maloláctica, siendo estos vinos los que presentaron una velocidad de consumo de ácido málico ligeramente mayor, en comparación con el activador comercial y el testigo. Una vez acabado el proceso, los vinos se clarificaron y se embotellaron con atmósfera inerte (N2). Los resultados de la caracterización de los vinos finales, blancos y tintos, no indicaron en ningún caso alteraciones en los parámetros físico-químicos, salvo ligeras modificaciones no significativas en los parámetros del color. Sin embargo, el análisis de los compuestos volátiles nuevamente indicó que el polen ejercía un efecto positivo sobre los vinos, incluso mejorando su composición en comparación con el activador comercial. En los vinos blancos de Palomino fino y Riesling con polen, se advirtió un comportamiento muy similar al de los experimentos con diferentes dosis de polen. De forma general, los mayores incrementos fueron observados en las familias de los alcoholes superiores, terpenos, ésteres y aldehídos, en los vinos con polen en comparación con los testigos. Mientras que, en los vinos tintos, las familias de compuestos con mayores incrementos fueron los alcoholes superiores, fenoles, terpenos, ésteres, tioles, norisoprenoides y lactonas. El estudio de los VAO mostró incrementos en las series odorantes con el uso del polen, frente al activador comercial, que presentó descensos en la mayoría de las series, sobre todo en las mayoritarias (afrutado, floral, grasa, herbáceo y frutos secos). Al comparar la acción conjunta de las series odorantes positivas (afrutado + floral) frente a las negativas (grasa + herbácea + frutos secos), la fracción correspondiente a las series odorantes positivas de los vinos con polen superaban el 92% con respecto al total, muy por encima del activador comercial y más aún de los vinos testigo. En séptimo lugar, los vinos obtenidos en los experimentos comparativos fueron analizados mediante el análisis sensorial descriptivo, además de aplicar la prueba triangular (ISO 4120:2007 AENOR, 2008) y el test de ordenación (ISO 8587:2006 AENOR, 2010). En este caso, no solo se obtuvo la información descriptiva de los vinos, sino que, mediante la aplicación de la prueba triangular, se pudo conocer si existían diferencias significativas entre los vinos elaborados con polen y con activador comercial. La información obtenida tras aplicar el test de ordenación, permitió conocer el grado de aceptación de los vinos, en comparación con los elaborados con activador comercial y los testigos. La evaluación de los atributos olfativos generales, mostró que tanto los vinos blancos como los tintos elaborados con polen, presentaron mayor intensidad en el carácter frutal y floral, en comparación con el activador comercial y el testigo. Al analizar los resultados de los atributos específicos, se observó que, en los vinos blancos, los incrementos en fruta eran debido a mayor proporción de aromas a frutas blancas, tropicales y cítricos, junto con un aumento en aromas a flores blancas. En los vinos tintos, los incrementos eran debido a mayor intensidad en frutas rojas, negras, tropicales y algo de frutas blancas, y en flores rojas y azules. Sin embargo, en todos los vinos con activador comercial, se percibió mayor intensidad aromática en frutas con hueso, fruta madura y en las notas balsámicas, por lo que estos vinos fueron peor evaluados que los elaborados con polen. Los resultados de las pruebas triangulares mostraron diferencias significativas entre todos los vinos de Riesling y los de Tintilla de Rota (control, polen y activador comercial), sin embargo, entre los vinos control y con polen de Palomino fino, no se encontraron diferencias. Por otro lado, el test de ordenación indicó que, de forma significativa en todos los casos, los vinos con polen fueron los preferidos por los catadores (“consumidores”). En el caso de Palomino fino, los vinos con mayor preferencia fueron, en igualdad de puntuaciones, los vinos con polen y los vinos con activador comercial. Dada la finalidad de este objetivo, este resultado debe considerarse igualmente positivo ya que estaría validando el efecto del polen en comparación a un activador comercial. En octavo lugar, durante el desarrollo de esta tesis doctoral, se ha realizado una estancia de investigación en el centro extranjero Institut des Sciences de la Vigne et du Vin (ISVV) de Burdeos (Francia), en la región de Aquitania, considerado como centro de referencia internacional en investigación en el campo de la enología. En el período de estancia, se efectuaron experimentos comparativos con polen de abeja y un activador comercial, utilizando las variedades tintas Cabernet sauvignon y Merlot. Debido a diferencias en la metodología utilizada en ambos centros de investigación, en el capítulo referente al estudio comparativo solo se han incluido los resultados de aquellos análisis realizados con metodología similar a los realizados en España. En este contexto, con las variedades tintas Francesas Cabernet sauvignon y Merlot, se estudió el impacto del uso de polen sobre los mostos, sobre la evolución de la densidad, sobre los parámetros físico-químicos y de color de los vinos finales, así como el análisis sensorial descriptivo de los atributos generales (carácter frutal, floral en nariz; dulzor, acidez, amargor, y astringencia, en boca), además de las pruebas triangulares y el test de ordenación. EL análisis de los mostos de ambas variedades no mostró alteraciones en los parámetros físico-químicos, salvo en el contenido inicial en NFA en los mostos con polen y activador comercial, al igual que se observó en los mostos de Tintilla de Rota. Durante el desarrollo de la fermentación alcohólica, el comportamiento de la cinética fermentativa fue muy parecido en Cabernet sauvignon y Merlot, salvo antes de alcanzar la recta final, donde se observaron diferencias significativas entre el polen y el testigo en Cabernet, y entre el polen y el activador comercial junto con el testigo en Merlot. Una vez finalizada la fermentación alcohólica, se siguió la misma metodología que en Tintilla de Rota, se inoculó un pie de cuba de bacterias ácido lácticas comerciales y se controló la evolución de la fermentación maloláctica mediante el seguimiento de los niveles de ácido málico. En ambos casos se observó un comportamiento similar, tanto el testigo como el polen de abeja, presentaron los descensos de ácido málico más acusados que el activador, causado posiblemente por algún problema de adaptación del inóculo al medio. Sin embargo, en la fermentación maloláctica, el perfil de consumo fue muy parecido en todos los vinos. Cuando terminó el proceso, los vinos limpios fueron embotellados con atmósfera inerte (N2) y conservados en refrigeración hasta su caracterización físico-química y su análisis sensorial. Es necesario indicar que, debido al ritmo marcado por el tiempo de la estancia, los vinos de Cabernet sauvignon y Merlot no tuvieron un tiempo de fermentación alcohólica más largo y por ello, el contenido en azúcares residuales es mucho mayor que en Tintilla de Rota, aunque en ambos casos se alcanzaron niveles inferiores a 2 g/L. Al igual que en los vinos de Tintilla de Rota, los resultados de los físico-químicos de los vinos, no mostraron diferencias elevadas entre ellos, salvo algunas en la acidez volátil y el contenido en azúcares residuales. Respecto a los parámetros de color, los vinos mostraron ligeros cambios en la componente b* con respecto a los vinos elaborados con polen. Mientras que en Cabernet sauvignon se incrementó levemente la componente amarilla, en Merlot los vinos presentaron más componente azul, cambios prácticamente imperceptibles desde una perspectiva visual. Por esta razón, las modificaciones no implicaron cambios perceptibles en los vinos desde el punto de vista enológico. Los resultados del análisis sensorial descriptivo de los vinos mostraron, al igual que en los vinos de Tintilla de Rota, que los atributos mejor puntuados en todos los casos fueron el carácter frutal y floral de los vinos con polen, en comparación con el activador comercial y testigo. El comportamiento en boca fue un poco diferente en ambas variedades. Los vinos de Cabernet con polen y control presentaron mayor amargor, que los vinos con activador comercial. En Merlot, los vinos con mayor intensidad de amargor fueron los vinos testigo y los elaborados con el activador comercial. La sensación de astringencia no presentó un comportamiento directamente asociado a la presencia de polen, ya que, en la variedad Merlot, los vinos con mayor astringencia fueron los elaborados con el activador comercial. Los resultados obtenidos de las pruebas triangulares mostraron que los vinos elaborados con polen y con el activador comercial presentaron perfiles sensoriales diferentes en comparación con el testigo. Sin embargo, al enfrentar los vinos con polen y con activador comercial, no se obtuvieron diferencias significativas entre los vinos. Esto puede indicar, que, a pesar de las diferencias sensoriales encontradas, existen pequeños matices en las notas de cata que pueden ser los responsables de marcar la diferencia entre los vinos. Los resultados del test de ordenación, indicaron que los vinos de Cabernet elaborados con polen fueron preferidos de forma significativa, frente al activador y a los vinos testigo. Mientras que, en los vinos de Merlot a pesar de ser los vinos con polen de abeja los más puntuados por los catadores, no se observaron diferencias significativas. Sin embargo, estas preferencias corroboran las mejoras en la calidad del aroma de los vinos, observadas en el análisis sensorial descriptivo. Como conclusión, se puede indicar que el uso de polen incrementa los niveles de NFA en los mostos de uva, tanto blanca como tinta. Del mismo modo, su uso favorece la cinética fermentativa y consigue aumentar la biomasa viable durante el desarrollo de la fermentación alcohólica. Cuando se utilizan dosis elevadas, los vinos blancos finales pueden alterar sensiblemente los parámetros del color, sin embargo, cuando se utiliza a dosis bajas no se producen modificaciones importantes en los vinos. Por otro lado, el uso de polen a dosis bajas, favorece e incrementa el contenido en compuestos volátiles que mejoran la calidad del perfil aromático de los vinos resultantes, tanto en blanco como en tinto, favoreciéndose la producción de compuestos implicados en las series odorantes de frutas y flores. Mientras que las dosis altas desequilibran, en cierto modo, el perfil de compuestos volátiles potenciando el carácter graso y herbáceo. En comparación con el uso de un activador comercial, el polen de abeja presenta mejores y más completas funcionalidades para su uso en la fermentación alcohólica. Por un lado, incrementa el contenido en NFA de los mostos, mejorando tanto la cinética fermentativa como la producción de biomasa viable, y por otro, favorece la producción de una mayor cantidad de compuestos volátiles que participan en las series odorantes responsables de los aromas afrutados y florales de los vinos. Los resultados del análisis sensorial descriptivo junto con la aplicación de la prueba triangular y el test de ordenación, muestran que, en la mayor parte de los casos, los vinos con mejores características sensoriales y con mayor preferencia, han sido los elaborados con polen de abeja en comparación con el uso de activadores comerciales.
Polen, Fermentación alcohólica, Activador fermentativo, NFA, Aromas, Cinética fermentativa
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