Investigação das etapas limitantes durante a síntese de Ácido Hialurônico em Kluyveromyces lactis

O ácido hialurônico (AH) é um biopolímero composto de repetições alternadas dos monossacarídeos Ácido Glucurônico e N-Acetil glucosamina, sendo presente em todos os vertebrados. O AH possui uma vasta gama de aplicações, porém, suas qualidades como agente rejuvenescedor da derme o tornam um produto muito utilizado na indústria farmacêutica e médica. Atualmente o AH é produzido naturalmente por bactérias que são patogênicas aos animais, o que dificulta o escalonamento esta tecnologia de produção e eleva os custos de purificação. Como uma alternativa a estas bactérias, leveduras e outras bactérias foram geneticamente modificadas para síntese de AH produzindo valores de 0.1 até 74 g/L. Uma cepa da levedura luyveromyces lactis, denominada cepa BAP, foi construída visando produzir AH através da inserção dos genes hasA (codificante da enzima Hialuronan Sintase) e hasB (codificante da enzima UDP-Glicose Desidrogenase). Porém, após cultivo em biorreator foi alcançada uma produção final de 1,89 g/L, um valor ainda considerado baixo quando comparado à outras cepas de bactérias geneticamente modificadas que alcançam valores de até 74 g/L de AH. De forma a otimizar a síntese de AH na cepa BAP e torná-la mais competitiva com outras cepas para a indústria, foram realizadas uma série de estudos na cepa BAP de forma a identificar possíveis etapas limitantes para a síntese de AH. Inicialmente, foram medidos por RT-qPCR e RNA-Seq os níveis de 20 transcritos na cepa BAP, todos envolvidos com enzimas consideradas potenciais competidoras da síntese de AH. A partir destes dados foi sugerido que a síntese de trealose seria o maior competidor da síntese de AH na célula. Uma nova cepa derivada da cepa AP contendo uma disrupção do gene tps1 e incapaz de sintetizar trealose foi gerada, porém, não houve melhora na síntese de AH. A partir dos resultados obtidos dos níveis de transcritos do gene hasA na cepa BAP também foi criada uma segunda estratégia para desacoplamento da síntese de AH com a síntese de biomassa em K. lactis através da utilização de um circuito genético guiado por uma enzima Serina Integrase 13. Porém, esta estratégia também não apresentou efeitos no melhoramento da síntese de AH devido a uma ativação inesperada da transcrição do gene da Integrase ocasionada pelo promotor LAC4. Por fim, foi realizada uma Análise de Fluxo Metabólico (AFM) na cepa BAP onde foi observado que a principal limitação da síntese de AH está em um fluxo insuficiente próximo de 0 da via do precursor UDP-GlcNAc, sendo necessárias estratégias envolvendo um aumento do fluxo desta via. Embora a síntese de AH pela cepa BAP não tenha sido melhorada, este estudo foi um dos primeiros a realizar uma AFM em células de K. lactis e o primeiro a realizar uma AFM em uma cepa produtora de AH visando avaliar como a síntese do AH é afetada pelas vias síntese dos seus 2 precursores.

Author dc:creator

• Gomes, Antonio Milton Vieira

Advisor dc:contributor.advisor

• Parachin, Nádia Skorupa

Statement dc:rights

• Acesso Aberto

Language dc:language.iso

Português

Repository record dc:identifier.uri

https://repositorio.unb.br/handle/10482/42613

OAI record oai:identifier

http://repositorio2.unb.br/oai/request?verb=GetRecord&metadataPrefix=dim&identifier=oai%3Arepositorio.unb.br%3A10482%2F42613