Struktur-/Funktionsbeziehung rekombinant hergestellter Proteine aus dem Byssusfaden der Miesmuschel Mytilus galloprovincialis

Marine Muscheln der Gezeitenzone, wie die Miesmuschel Mytilus galloprovincialis, haften mittels eines Byssus am Untergrund. Der Muschelbyssus besteht aus einzelnen Fäden, welche aufgrund von Strömungen und Wellengang extremen mechanischen Belastungen ausgeliefert sind und aus diesem Grund eine hohe Energieaufnahmefähigkeit besitzen. Unter anderem dieser Umstand macht die Byssusfäden zu einem interessanten biologischen Material. Byssusfäden gliedern sich in drei morphologisch unterscheidbare Abschnitte mit unterschiedlichen mechanischen Eigenschaften, einen elastischen proximalen Teil, einen distalen Teil mit hoher Steifigkeit und einen adhäsiven Plaque, welcher die Substratbindestelle darstellt. Der Byssus besteht fast ausschließlich aus Proteinen, wovon wiederum ein großer Teil des Fadens durch fibrilläre Kollagene repräsentiert ist, welche in eine Proteinmatrix eingebettet sind. Nahezu alle Proteine des Byssusfadens weisen z. T. einen hohen Grad an posttranslationalen Modifikationen auf, allen voran die Hydroxylierung von Tyrosinen zu 3,4-Dihydroxy-phenylalaninen (DOPA). Diese Reste nehmen eine Schlüsselrolle für die kohäsiven und adhäsiven Eigenschaften der Byssusproteine ein. Ferner spielt die Oxidation von DOPA zum entsprechenden o-Chinon eine wichtige Rolle bei der Quervernetzung der Proteine im Zuge der Reifung bzw. chinonbasierter Gerbung (quinone tanning) der Fäden. Diese Reaktion wird von einer im Byssusfaden detektierten Catecholoxidase katalysiert, von der bis dato jedoch keine Aminosäuresequenz bekannt war. Im Rahmen dieser Arbeit wurde erstmalig die Sequenz einer solchen mutmaßlichen Byssuscatecholoxidase in einer cDNA-Bank des Muschelfußes identifiziert und eingehend bioinformatisch hinsichtlich Lokalisierung und potenzieller Tertiärstruktur charakterisiert. Das entsprechende Protein weist einige Charakteristika auf, die die Identität mit einer von J. H. Waite aus dem Byssusfaden isolierten Catecholoxidase wahrscheinlich machen. Neben einer katalytischen Domäne, welche Homologie zu bekannten Catecholoxidasen bzw. Tyrosinasen aufweist, zeigt das Protein ferner weitere spezielle Bereiche, die eine strukturelle Beteiligung des Proteins am Byssusfaden nahelegen. Den Hauptteil der Arbeit stellt die Analyse eines der bekannten Matrixproteine dar, des Proximalen Fadenmatrixproteins 1 (PTMP1), welches zwei Von-Willebrand-Faktor Typ A-ähnliche (VWA) Domänen besitzt. Hierzu wurde zunächst die Sequenz von PTMP1 aus einer cDNA-Bank des Muschelfußes isoliert und kloniert. Anschließend erfolgte die heterologe Expression und rekombinante Produktion des Proteins und einiger davon abgeleiteten Varianten in E. coli. Da alle Proteine in Form unlöslicher bakterieller Inclusion Bodies gebildet wurden, erfolgten die Etablierung einer Reinigungs- und Rückfaltungsstrategie sowie die chromatographische Analyse und spektroskopische Charakterisierung. Dabei wies PTMP1 zwei monomere Isoformen mit unterschiedlicher Disulfidverbrückung auf. Die Kristallstruktur von PTMP1, welche die erste bekannte Kristallstruktur eines Byssusproteins darstellt, zeigte eine neuartige Anordnung der beiden VWA-Domänen, welche dabei durch einen hochgradig stabilisierten Linker verbunden sind. Ferner konnte im Kristall die Bindung zweier Zinkionen an PTMP1 nachgewiesen werden, wobei jedoch nur das MIDAS-Motiv der A1-Domäne von PTMP1, jedoch nicht das der A2-Domäne diese Bindung aufwies. Die zweite Bindestelle wurde stattdessen im Bereich des Domänenlinkers detektiert. PTMP1 wies eine außergewöhnliche strukturelle Stabilität auf, insbesondere gegenüber thermischer Denaturierung. Die zuvor postulierte Fähigkeit von PTMP1 zur Bindung von Kollagenen konnte bestätigt und vertiefend analysiert werden. Dabei zeigte sich ein signifikanter Einfluss der Bindung von der Ionenstärke, sodass von elektrostatischen Interaktionen zwischen PTMP1 und Kollagen ausgegangen werden kann. Darüber hinaus besitzt PTMP1 die Fähigkeit zur Bindung tripelhelikaler kollagenartiger Strukturen. Die geordnete Assemblierung präformierter Kollagenfibrillen erwies sich in Anwesenheit von PTMP1 als signifikant gestört. Darüber hinaus beeinflusst PTMP1 die Bildung von Fibrillen aus löslichem Kollagen, was eine Beteiligung dieses Matrixproteins an der Assemblierung der Byssuskollagene und somit einen Einfluss auf die mechanischen Eigenschaften des proximalen Byssusfadenteils nahelegt.

Level thesis:degree_level

thesis.doctoral

Grantor dc:publisher

Universität Bayreuth

Year

2013

Author dc:creator

• Suhre, Michael H.

Contributors dc:contributor

• Scheibel, Thomas

Repository record source_url

https://epub.uni-bayreuth.de/id/eprint/95/

OAI identifier oai:identifier

oai:epub.uni-bayreuth.de:95