Bestimmung der Struktur der 15. Domäne des Multidomäneninhibitors LEKTI mittels NMR-Spektroskopie und Design einer inhibitorisch wirksamen Mutante
In der vorliegenden Arbeit wurde die Struktur der 15. Domäne des Multidomänen-Inhibitors LEKTI mittels NMR-Spektroskopie bestimmt, sowie die inhibitorischen Eigenschaften dieser Domäne untersucht. Das Vorläuferprotein LEKTI (lympho-epithelial Kazal-type-related inhibitor) umfasst fünfzehn Domänen, von denen die 2. und 15. Domäne zwar ein typisches Kazalmotiv zeigen, jedoch anstatt der für klassische Kazalvertreter üblichen sechs 12-13 Reste zwischen den ersten beiden Cysteinen aufweisen. Bei der schweren autosomal rezessiven Erbkrankheit Netherton Syndrom werden Mutationen im LEKTI-Gen gefunden, die eine vorzeitige Termination der Translation verursachen und daher nur zu verkürzt gebildetem LEKTI-Protein führen. Da die LEKTI-Domäne 15 bei Patienten mit Netherton Syndrom nicht exprimiert wird, ist diese besonders interessant. Einige Symptome des Netherton Syndroms legen eine Fehlregulierung der Proteinase Tryptase nahe, da diese eine Schlüsselrolle bei Überempfindlichkeitsreaktionen und Asthma einnimmt. Bei einem Sequenzvergleich des bislang einzig bekannten natürlich vorkommenden Tryptase-Inhibitors LDTI (leech derived tryptase inhibitor) mit den LEKTI-Domänen wurde eine signifikante Homologie zwischen Domäne 15 und LDTI insbesondere im Bereich der Bindungsschleife gefunden, weswegen eine regulatorische Funktion von LEKTI gegenüber Tryptase vermutet wird. Nachdem kein natürliches Material zur Verfügung stand, war es zur Gewinnung ausreichender Mengen rekombinanten Proteins, wie es für die Bestimmung der Struktur und der inhibitorischen Wirkung erforderlich ist, notwendig, ein geeignetes Expressions- und Reinigungssystem zu entwickeln. Obwohl es inzwischen einige Hinweise auf eine mögliche Prozessierung von LEKTI gibt, ist die natürliche Proteinsequenz der Domäne 15 noch nicht bekannt. Nach Vergleichen mit Kazalvertretern wurde ein 76 Aminosäuren großes Protein (dom15) hergestellt. Wie die strukturelle Charakterisierung ergab, ist dessen COOH-terminaler Abschnitt nicht strukturiert, weswegen eine COOH-terminal verkürzte Variante (dom15kurz) hergestellt wurde, die auch die Auflösung von Mehrdeutigkeiten bei NOE-Kreuzresonanzen erlaubte. Aus den homonuklearen und 15N-editierten NMR-Spektren wurden 887 (dom15kurz) bzw. 908 (dom15) experimentelle Randbedingungen gewonnen, die die Berechnung einer jeweils hochaufgelösten Struktur mit einem RMSD-Wert von 0,5 Å für die schweren Atome des Proteinrückgrats bzw. von 1,0 Å für alle schweren Atome ermöglichten. Beide Varianten zeigen ein typisches Kazal-Strukturmotiv bestehend aus einem dreisträngigen beta- Faltblatt, einer zentralen alpha-Helix und einer exponierten kanonischen Bindungsschleife. Die gegenüber klassischen Kazalvertretern zusätzlichen Reste zwischen den ersten beiden Cysteinen sind teilweise an der Ausbildung einer weiteren aminoterminalen kurzen Helix und einem hairpin-ähnlichen Motiv beteiligt und so angeordnet, dass der klassische Kazal-Faltungstyp nicht gestört wird. Sowohl die kurze als auch die lange Domäne 15-Variante zeigt eine starke und nicht-temporäre kompetitive Inhibierung von Trypsin und Plasmin bei Werten für die Inhibitionskonstanten im einstelligen nM-Bereich, jedoch keine inhibitorische Wirkung gegenüber Tryptase. Aufgrund des identischen Verhaltens dieser beiden Domäne 15-Varianten gegenüber verschiedenen getesteten Proteinasen ist anzunehmen, dass der COOH-Terminus keinen Einfluss auf die inhibitorische Wirkung der LEKTI-Domäne 15 hat. Außerdem wurde in Anlehnung an LDTI eine Variante der Domäne 15 mit nur einer Aminosäure zwischen den ersten beiden Cysteinen (dom15ldti) hergestellt. Nach oxidativer Rückfaltung zeigte dom15ldti ebenfalls eine starke inhibitorische Wirkung gegenüber Trypsin und Plasmin, wie sie auch für dom15 und dom15kurz beobachtet wurde. Dies deutet auf eine starre Bindungsschleife und ein hoch stabilisiertes Proteingerüst hin. Daher wurde ein Strukturmodell für dom15ldti auf Basis der experimentell bestimmten Struktur von dom15kurz erstellt. Reoxidiertes dom15ldti zeigte eine Inhibierung von Chymotrypsin, Elastase und Subtilisin, während dies weder für dom15 noch für dom15kurz beobachtet wurde. Dies lässt darauf schließen, dass der Bereich zwischen den ersten beiden Cysteinen einen Einfluss darauf hat, welche Proteinase inhibiert wird. Aus Überlagerungen der Strukturen von dom15kurz und der Modellstruktur von dom15ldti mit verschiedenen Proteinase-Inhibitor-Komplexstrukturen kann eine sterische Hinderung als mögliche Ursache für das unterschiedliche inhibitorische Verhalten gegenüber verschiedenen Proteinasen abgeleitet werden. Diese Erkenntnis stellt eine mögliche Grundlage für gezielte Veränderungen einer inhibitorischen Selektivität dar. Außerdem erleichtert die Kenntnis der dreidimensionalen Struktur der LEKTI-Domäne 15 die Suche nach der immer noch unbekannten Zielproteinase.
Networked Digital Library of Theses and Dissertations