Immobilisation von Enzymen auf sphärischen Polyelektrolytbürsten
In dieser Arbeit wurde die adsorptive Immobilisation von Enzymen auf kolloidalen Partikeln untersucht. Diese Partikel bestehen aus Polystyrolkernen auf denen Polymerketten durch eine grafting from-Technik angeknüpft wurden. Sie werden als sphärische Polyelektrolytbürsten bezeichnet. Die Parameter dieser Partikel lassen sich gezielt über die Synthese einstellen. Durch die hohe Oberflächendichte wird ein so genannter brush erhalten, d.h. eine Schicht von Polymerketten, die fest an eine Oberfläche geknüpft sind und deren benachbarten Ketten sich deutlich überlappen. Der Dissoziationsgrad der geladenen Gruppen ist für annealed brushes, die aus schwachen Polyelektrolyten aufgebaut sind, vom pH-Wert abhängig. Für quenched brushes, deren Ketten aus starken Elektrolyten aufgebaut sind, ist der Dissoziationsgrad unabhängig vom pH-Wert. In Abwesenheit von Fremdsalzionen sind die Gegenionen der Polyelektrolytketten innerhalb des brush gefangen und die Ketten werden durch den resultierenden hohen osmotischen Druck bis fast an ihre Konturlänge gestreckt. Es wird hier von einem osmotic brush gesprochen. Für die hier durchgeführten Adsorptionsexperimente wurden drei verschiedene Enzyme verwendet: Glucoamylase, alpha-D-Glucosidase und beta-D-Glucosidase. Als Triebkraft der Adsorption trotz gleichnamiger Ladung der Trägerpartikel und der Enzyme wurde die counterion release force diskutiert: Die positiv geladenen Bereiche eines überwiegend negativ geladenen Enzyms wechselwirken mit negativ geladenen Ketten eines brush. Das zu adsorbierende Protein besitzt N+ positive und N- negative Ladungen. Durch die Adsorption werden nun je N+ Gegenionen des Enzyms und der Polymerketten frei gesetzt und N- Gegenionen in den brush aufgenommen. Somit werden 2 N+ - N- Gegenionen frei gesetzt und erhöhen die Entropie. Für die Beschreibung der Adsorptionskurven wurde ein Modell entwickelt, das als Grenzfälle die Langmuir-, Langmuir-Freundlich- und Brunnauer-Emmet-Teller-Theorie enthält. Allerdings wurde hier nicht von reversiblen Gleichgewichtszuständen ausgegangen. Die Adsorption von flexiblen Enzymen folgte einem BET-Verlauf. Ein Langmuir-Freundlich Verlauf wurde für globuläre Proteine beobachtet. Die Immobilisation von Glucoamylase lieferte sowohl für ein annealed- als auch für ein quenched brush-System übereinstimmende Ergebnisse. Dies kann mit der im Vergleich zur Adsorption von BSA geringeren Wechselwirkung zwischen Glucoamylase und brush erklärt werden. Die Aktivität der adsorbierten Enzyme wurde untersucht und die Ergebnisse mittels Michaelis-Menten-Kinetik ausgewertet. Diese liefert die Parameter Michaelis-Konstante KM und die Wechselzahl kcat. Als Untersuchungsmethoden standen UV/VIS-Spektroskopie und isotherme Titrationskalorimetrie (ITC) zur Verfügung. Aktivitätsuntersuchungen von gelösten Enzymen unter gleichen Bedingungen dienten als Vergleich für die immobilisierten Enzyme. Für ein annealed und ein quenched brush-System konnte durch Untersuchungen von adsorbierter Glucoamylase gezeigt werden, dass die KM-Werte der immobiliserten Enzyme sich nicht signifikant im Vergleich zur Michaelis-Konstante des nativen Enzyms ändern. Untersuchungen von alpha- und beta-D-Glucosidase wurden mittels UV/VIS-Spektroskopie und ITC durchgeführt. Es wurde hier ebenfalls ein Erhalt der enzymatischen Aktivität gefunden. Für beta-D-Glucosidase konnte beobachtet werden, dass die KM-Werte mit steigender Beladung sich dem des nativen Enzyms annähern und für höchste Beladungen identisch sind. UV/VIS-Spektroskopie und ITC liefern vergleichbare Daten. ITC eignet sich somit als Untersuchungsmethode für die Enzymaktivität. Die Wechselzahl der immobilisierten Enzyme war in allen Messungen herabgesetzt. Besonders ausgeprägt war dieser Abfall für alpha-D-Glucosidase. Da KM erhalten bleibt und Konformationsuntersuchungen anderer adsorbierter Proteine zeigten, dass Adsorption nicht zu starken Konformationsänderungen führt, kann dieser Aktivitätsverlust nicht durch Störung der Konformation auftreten. Die verringerte Aktivität ist auf zur Vergleichsmessung unterschiedliche Bedingungen zurückzuführen. So ist der pH-Wert innerhalb des brush abgesenkt und die Ionenstärke erhöht. Es herrschen für innerhalb des brush adsorbierte Enzyme veränderte Bedingungen, die sich nach außen hin denen in Lösung angleichen. Enzyme, deren Aktivität für niedrige pH-Werte abgesenkt ist, erniedrigen somit kcat. Alpha-D-Glucosidase ist für pH-Werte kleiner als fünf nicht mehr im verwendeten Test aktiv. Zudem zeigten Untersuchungen, dass kcat abhängig von der Vorbehandlung des Enzyms ist. Es konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass durch Adsorption von Enzymen eine hohe Beladung sphärischer Polyelektrolytbürsten möglich ist. Durch diese einfache Vorgehensweise konnten mit Enzym beladene Trägerpartikel erhalten werden, die unter Erhalt der KM-Werte enzymatisch aktiv waren. Somit eignen sich sphärische Polyelektrolytbürsten ideal als Trägerpartikel für die Immobilisation von Enzymen.
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