Konformationsänderungen im katalytischen Zyklus der RNA-Helikase YxiN - Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer in einzelnen Molekülen
type: CreativeWork
description: Die Aufhebung von RNA-Sekundärstrukturen und RNA-Protein-Wechselwirkungen durch RNA-Helikasen ist für viele zelluläre Prozesse von grundlegender Bedeutung. Die RNA-Helikase YxiN aus Bacillus subtilis ist an der Biogenese der Ribosomen beteiligt. YxiN besitzt neben den beiden konservierten Helikasedomänen eine dritte, RNA-bindenden Domäne, die für die Sequenzspezifität verantwortlich ist. In dieser Arbeit wurden Konformationsänderungen im katalytischen Zyklus von YxiN mittels Einzelmolekül-FRET-Experimenten untersucht, um Einblick in den Mechanismus der RNA-Entwindung zu erhalten. Rekombinantes YxiN konnte in nativer Form aus Escherichia coli gereinigt werden. YxiN bindet Adeninnukleotide und zeigt eine feste Bindung von RNA. In gekoppelten spektroskopischen Tests wurde die RNA-abhängige ATP-Hydrolyse beobachtet. Die ATP-abhängige RNA-Entwindung wurde in einem dafür entwickelten fluoreszenzbasierten Test in Polyacrylamidgelen nachgewiesen. Für Einzelmolekül-FRET-Experimente wurde YxiN mit zwei Fluorophoren markiert. Dazu mussten zunächst die zugänglichen Cysteine des Wildtyps durch Serin ersetzt werden. Anschließend wurden Cysteine an potentiell lösungsmittelzugänglichen Positionen eingeführt und durch Reaktion mit Dithionitrobenzoat (DTNB) und Tetramethylrhodamin-Maleimid auf ihre Zugänglichkeit getestet. Die Reaktivität der Cysteine mit farbstoffgekoppeltem Maleimid unterschied sich dabei deutlich von der Reaktivität mit DTNB. Die YxiN-Mutanten mit zugänglichen Cysteinen zeigten ähnliche Stabilität und Aktivität wie der Wildtyp. YxiN-Mutanten mit je einem zugänglichen Cystein in beiden Helikasedomänen wurden mit Alexa488 als Fluoreszenzdonor und Tetramethylrhodamin als Akzeptor markiert. Mit limitierter Proteolyse und anschließender Detektion der Fluoreszenz der Fragmente in Polyacrylamidgelen konnte die Orientierung der Fluorophore in YxiN überprüft werden. In Ensemble-Fluoreszenzspektren von doppelt markiertem YxiN konnten keine Änderungen der FRET-Effizienz bei …
abstract: Die Aufhebung von RNA-Sekundärstrukturen und RNA-Protein-Wechselwirkungen durch RNA-Helikasen ist für viele zelluläre Prozesse von grundlegender Bedeutung. Die RNA-Helikase YxiN aus Bacillus subtilis ist an der Biogenese der Ribosomen beteiligt. YxiN besitzt neben den beiden konservierten Helikasedomänen eine dritte, RNA-bindenden Domäne, die für die Sequenzspezifität verantwortlich ist. In dieser Arbeit wurden Konformationsänderungen im katalytischen Zyklus von YxiN mittels Einzelmolekül-FRET-Experimenten untersucht, um Einblick in den Mechanismus der RNA-Entwindung zu erhalten. Rekombinantes YxiN konnte in nativer Form aus Escherichia coli gereinigt werden. YxiN bindet Adeninnukleotide und zeigt eine feste Bindung von RNA. In gekoppelten spektroskopischen Tests wurde die RNA-abhängige ATP-Hydrolyse beobachtet. Die ATP-abhängige RNA-Entwindung wurde in einem dafür entwickelten fluoreszenzbasierten Test in Polyacrylamidgelen nachgewiesen. Für Einzelmolekül-FRET-Experimente wurde YxiN mit zwei Fluorophoren markiert. Dazu mussten zunächst die zugänglichen Cysteine des Wildtyps durch Serin ersetzt werden. Anschließend wurden Cysteine an potentiell lösungsmittelzugänglichen Positionen eingeführt und durch Reaktion mit Dithionitrobenzoat (DTNB) und Tetramethylrhodamin-Maleimid auf ihre Zugänglichkeit getestet. Die Reaktivität der Cysteine mit farbstoffgekoppeltem Maleimid unterschied sich dabei deutlich von der Reaktivität mit DTNB. Die YxiN-Mutanten mit zugänglichen Cysteinen zeigten ähnliche Stabilität und Aktivität wie der Wildtyp. YxiN-Mutanten mit je einem zugänglichen Cystein in beiden Helikasedomänen wurden mit Alexa488 als Fluoreszenzdonor und Tetramethylrhodamin als Akzeptor markiert. Mit limitierter Proteolyse und anschließender Detektion der Fluoreszenz der Fragmente in Polyacrylamidgelen konnte die Orientierung der Fluorophore in YxiN überprüft werden. In Ensemble-Fluoreszenzspektren von doppelt markiertem YxiN konnten keine Änderungen der FRET-Effizienz bei …
author: Theißen, Bettina
date published: 2006-07-20
date modified: 2026-07-27T18:49:26Z
provider: Universität Bayreuth
publisher: Networked Digital Library of Theses and Dissertations
type: WebPage
source organization: Universität Bayreuth