Konformationsänderungen im katalytischen Zyklus der RNA-Helikase YxiN - Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer in einzelnen Molekülen
Die Aufhebung von RNA-Sekundärstrukturen und RNA-Protein-Wechselwirkungen durch RNA-Helikasen ist für viele zelluläre Prozesse von grundlegender Bedeutung. Die RNA-Helikase YxiN aus Bacillus subtilis ist an der Biogenese der Ribosomen beteiligt. YxiN besitzt neben den beiden konservierten Helikasedomänen eine dritte, RNA-bindenden Domäne, die für die Sequenzspezifität verantwortlich ist. In dieser Arbeit wurden Konformationsänderungen im katalytischen Zyklus von YxiN mittels Einzelmolekül-FRET-Experimenten untersucht, um Einblick in den Mechanismus der RNA-Entwindung zu erhalten. Rekombinantes YxiN konnte in nativer Form aus Escherichia coli gereinigt werden. YxiN bindet Adeninnukleotide und zeigt eine feste Bindung von RNA. In gekoppelten spektroskopischen Tests wurde die RNA-abhängige ATP-Hydrolyse beobachtet. Die ATP-abhängige RNA-Entwindung wurde in einem dafür entwickelten fluoreszenzbasierten Test in Polyacrylamidgelen nachgewiesen. Für Einzelmolekül-FRET-Experimente wurde YxiN mit zwei Fluorophoren markiert. Dazu mussten zunächst die zugänglichen Cysteine des Wildtyps durch Serin ersetzt werden. Anschließend wurden Cysteine an potentiell lösungsmittelzugänglichen Positionen eingeführt und durch Reaktion mit Dithionitrobenzoat (DTNB) und Tetramethylrhodamin-Maleimid auf ihre Zugänglichkeit getestet. Die Reaktivität der Cysteine mit farbstoffgekoppeltem Maleimid unterschied sich dabei deutlich von der Reaktivität mit DTNB. Die YxiN-Mutanten mit zugänglichen Cysteinen zeigten ähnliche Stabilität und Aktivität wie der Wildtyp. YxiN-Mutanten mit je einem zugänglichen Cystein in beiden Helikasedomänen wurden mit Alexa488 als Fluoreszenzdonor und Tetramethylrhodamin als Akzeptor markiert. Mit limitierter Proteolyse und anschließender Detektion der Fluoreszenz der Fragmente in Polyacrylamidgelen konnte die Orientierung der Fluorophore in YxiN überprüft werden. In Ensemble-Fluoreszenzspektren von doppelt markiertem YxiN konnten keine Änderungen der FRET-Effizienz bei der Substratbindung detektiert werden. In Einzelmolekül-FRET-Experimenten hingegen konnten zwei verschiedene Zustände mit unterschiedlicher FRET-Effizienz identifiziert werden, die zwei verschiedenen Konformationen entsprechen. Die offene Konformation des freien YxiN bleibt auch in Gegenwart von Nukleotiden erhalten. Die zweite, geschlossene Konformation tritt erst in Gegenwart von RNA auf und wird bei der Bindung von ATP stärker populiert. Auf der Grundlage dieser Ergebnisse wird für den Mechanismus der RNA-Entwindung durch YxiN ein erweitertes Destabilisierungsmodell vorgeschlagen. Die C-terminale RNA-Bindungsdomäne positioniert dabei die Helikase sequenzspezifisch auf der RNA. Die beiden Helikasedomänen binden unspezifisch an einzelsträngige RNA oder den Übergang von Einzelstrang zu Doppelstrang in der Umgebung. Dabei schließt sich der Spalt zwischen den Domänen. Die Hydrolyse von ATP oder die anschließende Freisetzung von ADP führt zu der Destabilisierung einiger Basenpaare des RNA-Doppelstranges, so dass ein kurzer RNA-Doppelstrang dissoziieren kann. Einzelmolekül-FRET-Experimente eignen sich also zur Beobachtung von Konformationsänderungen in YxiN und liefern damit Einblick in den Mechanismus der RNA-Helikase. Weiterführende Experimente werden ein detailliertes Verständnis für den Mechanismus der RNA-Entwindung durch YxiN ermöglichen.
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