Partikel und Kapseln auf Basis des rekombinanten Spinnenseidenproteins eADF4(C16)

Natürliche Spinnenseide als Biomaterial wird aufgrund seiner einzigartigen mechanischen Eigenschaften und seiner guten Biokompatibilität schon seit Jahrhunderten vom Menschen genutzt. Hierbei sind insbesondere die Proteine des Abseilfadens der Gartenkreuzspinne A. diadematus von Interesse. Der Abseilfaden setzt sich aus mehreren Proteinkomponenten zusammen, eine dieser Komponenten ist das Protein ADF4, diesem nachempfunden ist das rekombinant hergestellte Protein eADF4. ADF4 besteht aus bis zu 100 Wiederholungen einer repetitiven Kernsequenz, welche von nicht-repetitiven terminalen Regionen flankiert wird. eADF4 besteht aus dieser, jedoch für E. coli optimierten, Kernsequenz (C-Modul). In dieser Arbeit lag das Hauptaugenmerk auf eADF4(C16). Dieses besteht aus 16 Wiederholungen des C-Moduls, das daraus resultierende Protein hat ein Molekulargewicht von ca. 47 kDa. Die kontrollierte und gezielte Freisetzung von Wirkstoffen oder Enzymen (controlled drug delivery) ist ein wichtiges Forschungsgebiet sowohl in der Pharmazie als auch in der Medizin. Mittels controlled drug delivery sollen Probleme der herkömmlichen Medikamentation behoben werden. Hierzu zählen beispielsweise Nebenwirkungen die aufgrund einer sehr hohen lokalen Wirkstoffkonzentration nach Injektion des Wirkstoffs oder nach Auflösen einer Tablette am Wirkort auftreten können. Um dies zu minimieren, sollen Depotsysteme Medikamente kontrolliert über einen längeren Zeitraum am gewünschten Wirkort abgeben. Hierfür eignen sich insbesondere mobile Systeme, wie Partikel und Kapseln. Bei Partikeln aus eADF4(C16) handelt es sich um Vollkugeln, welche durch Aussalzprozesse aus wässriger Lösung hergestellt werden. Sie eignen sich insbesondere für den Transport von wasserlöslichen Stoffen, was am Beispiel Rhodamin B gezeigt wurde. Die Beladung der Partikel erfolgt hierbei auf zwei verschiedene Arten. Zum einen durch Eindiffundieren der Wirkstoffe in die fertig ausgebildeten Partikel, zum anderen durch co-Präzipitation des Wirkstoffs zusammen mit dem Protein. Es konnte gezeigt werden, dass die Beladung der Partikel mit Wirkstoffen durch co-Präzipitation im Vergleich zu Diffusionsprozessen deutlich erhöht werden konnte. Zusätzlich sollte durch Vernetzungsprozesse (crosslinking) Einfluss auf die Wirkstofffreisetzung genommen werden. Dies konnte jedoch nicht in vollem Umfang erzielt werden. Es konnte jedoch gezeigt werden, dass chemisches Vernetzen einen deutlichen Einfluss auf die chemische Stabilität der Partikel hat und dass sowohl chemisches als auch physikalisches Vernetzen die Mechanik der Partikel stark beeinflusst. Zusätzlich konnte das Quellverhalten der Partikel analysiert werden, was einen entscheidenden Einfluss auf ihre Lagerstabilität aufweist. Sowohl die Mechanik als auch die Oberflächeneigenschaften der Partikel sind wichtige Parameter in Bezug auf weitere Anwendungsmöglichkeiten. Insbesondere im Bereich der Kompositmaterialien sind die Partikel vielseitig einsetzbar. Durch Inkorporation von eADF4 Partikeln in eine Matrix können die mechanischen Eigenschaften des Matrixmaterials möglicherweise stark verbessert werden und durch die Bioabbaubarkeit der Partikel ergeben sich weitere Möglichkeiten im Bereich von Knochenersatzmaterialien. Bei Kapseln handelt es sich um flüssigkeitsgefüllte Systeme, die von einem dünnen, aber stabilen Seidenfilm umhüllt sind. Die Kapselherstellung erfolgt mittels Grenzflächenpolymerisation an der Grenzfläche zwischen Öl und Wasser. Das bisher etablierte System basiert auf der Verwendung von Toluol, welches in Hinblick auf eine medizintechnische Anwendung bedenklich ist. Kapseln als Transportsystem eignen sich sowohl für schlechtlösliche als auch für gut-wasserlösliche Wirkstoffe mit einem Molekulargewicht größer als 30 kDa. Durch die Herstellung von Kapseln mittels Silikonöl anstatt Toluol, konnte ihre Verwendung als Transportsystem für Enzyme erfolgreich gezeigt werden. Dies erfolgte mittels -Galaktosidase als Modellenzym. Die Substrate können, aufgrund der semi-permeablen Kapselhülle, in die Kapseln eindiffundieren, bestimmte Proteasen mit entsprechend großem Molekulargewicht werden jedoch abgehalten. Ein Vorteil der Spinnenseidenkapseln gegenüber anderen Systemen ist, dass auch inaktive Enzyme verkapselt und am Wirkort durch Zugabe des Aktivators gezielt aktiviert werden können. Um eine möglichst homogene Größenverteilung der Kapseln zu erzielen, wurde eine Herstellung mittels Mikrofluidik erprobt. Um die Anwendbarkeit von eADF4 Proteinen im medizinischen oder pharmazeutischen Bereich sicherstellen zu können ist die Sterilität der Proteine ein entscheidendes Kriterium. Rekombinante Proteine, speziell solche, die in Bakterien produziert wurden, sind in der Regel auch nach Aufreinigung unsteril. Aus diesem Grund wurden in meiner Arbeit verschiedene Sterilisationsmethoden getestet und ihre Auswirkungen auf die rekombinanten Spinnenseidenproteine analysiert.

Level thesis:degree_level

thesis.doctoral

Grantor dc:publisher

Universität Bayreuth

Year

2013

Author dc:creator

• Blüm, Claudia

Contributors dc:contributor

• Scheibel, Thomas

Repository record source_url

https://epub.uni-bayreuth.de/id/eprint/71/

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oai:epub.uni-bayreuth.de:71