Effiziente Methoden zur chemo enzymatischen Synthese von komplexen N-Glycanen des bisecting Typs
Viele Proteine in der Zellmembran oder im Blutserum sind in eukaryotischen Organismen glycosyliert. Da die Kohlenhydratstrukturen verschiedene Aufgaben erfüllen, ist die Zugänglichkeit uniformer Glycoproteine für die Untersuchung von Struktur-Wirkungsbeziehungen nötig. Aufgrund der Mikroheterogenität ist die Isolierung von N-Glycanen aus Glycoproteinen erschwert. Daher stellt die chemische Synthese eine gute Alternative dar. Relativ selten in der Natur kommen N-Glycane des bisecting-Typs vor, deren Synthese in der vorliegenden Arbeit beschrieben wird. Diese Verbindungen sollen für die Untersuchung von Wechselwirkungen mit Lectinen, Seren oder Antikörpern auf Glycochips bereitgestellt werden. Substituierte N-Glycane können aus modularen Bausteinen hergestellt werden, aus denen auch ein pentaantennäres N-Glycan mit bisecting-GlcNAc und Core-Fucose synthetisiert werden sollte. Hierbei zeigte sich, dass die Ausbeute der sterisch anspruchsvollen Glycosylierung des hoch verzweigten alpha-1,6-Arms an den Heptasaccharidakzeptor von zwei Schlüsselschutzgruppen abhängt. Bei der Verwendung von zwei verschiedenen Donorbausteinen, bei denen die peripheren Aminogruppen durch Phthalimidoschutzgruppen geschützt wurden, wirkte sich das Fehlen der 3-Acetatschutzgruppe an der Mannose positiv auf die Ausbeuten aus. Einen ähnlichen Effekt hatte der Austausch der sperrigen Phthalimidoschutzgruppen gegen kleinere Trifluoracetamide in den Donoren. Mit diesen Bausteinen konnte die Ausbeute weiter verbessert werden, was auf elektronischen und sterischen Effekten beruhen sollte. Nach der Optimierung der Glycosylierung zu pentaantenären Strukturen wurde eine Core-Fucose eingeführt und die basenlabilen Schutzgruppen wurden entfernt. Damit konnte eine vielseitige Einsetzbarkeit der modularen Bausteine mit der Trifluoracetamidschutzgruppe gezeigt werden. Aufgrund dieser Ergebnisse wurden neue modulare Bausteine entwickelt, um die Synthese der verschieden verzweigten N-Glycane und die nachträgliche Einführung eines bisecting-GlcNAc-Rests zu untersuchen. Durch die unterschiedliche Kombination der neuen Antennendonoren mit dem Core-Trisaccharid konnten die komplexen N-Glycane mit zwei bis vier Antennen hergestellt werden. Für die Glycosylierungsreaktionen mussten aufgrund der erhöhten Reaktivität der trifluoracetamidgeschützten Donorbausteine geeignete Reaktionsbedingungen ermittelt werden. Die Regio- und Stereoselektivität in diesen Reaktionen wurde über die Konzentration und Temperatur der Reaktionsansätze gesteuert und ungewollte Überreaktion an benachbarten Hydroxylgruppen konnte damit unterdrückt werden. Mit Hilfe des GlcNAc-Donors konnte der bisecting-Rest nachträglich in die N-Glycane eingeführt werden. Durch die modularen trifluoracetamidgeschützten Bausteine wurden N-Glycane mit und ohne bisecting-GlcNAc in einer Syntheseroute erhältlich und die bisherige Verwendung einer temporären Chloracetatschutzgruppe unnötig. Es wurde zusätzlich die sequentielle Einführung des alpha-1,6-Arms und des bisecting-GlcNAc-Rests in regio- und stereoselektiven Eintopfreaktionen gezeigt. Auf diese Weise konnten auch das komplexe pentaantennäre N-Glycan und ein N-Glycan des Hybridtyps mit bisecting-Substitution hergestellt werden. Die vier chemisch synthetisierten N-Glycane des bisecting-Typs wurden in sechs Reaktionsschritten entschützt, an den bifunktionalen Spacer für die Immobilisierung auf Glycochips geknüpft und an den terminalen N-Acetylglucosaminyleinheiten mit Glycosyltransferasen enzymatisch verlängert. Hierbei wurden zuerst Galactosen beta-1,4-glycosidisch angeknüpft, an welche Sialinsäuren alpha-2,3- oder alpha-2,6-glycosidisch gebunden werden konnten. Somit wurden für die Immobilisierung auf den N-Glycanchips erstmals 17 komplexe N-Glycane mit bisecting-GlcNAc zur Verfügung gestellt. Außerdem wurde in weiteren Versuchen die Kopplung von N-Glycanen an die Seitenkette des Asparagins untersucht. Hierzu wurde das Core-Trisaccharid nach Reduktion des Azids an ein Asparaginsäureamid geknüpft und anschließend entschützt. Außerdem konnte das Glycosylhydroxylamin selektiv über eine decarboxylative Kondensation an ein Aminosäurederivat gebunden werden.
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