Das Gen-3-Protein filamentöser Phagen als Modellsystem zur Untersuchung von Proteinstabilität, Faltungsmechanismen und Prolylisomerisierung
Proteine sind die funktionstragenden Moleküle in lebenden Zellen und ihre pharmazeutische und biotechnologische Anwendung gewinnt zunehmend an Bedeutung. Um ihre Funktion zu erlangen, müssen Proteine falten und die gefaltete Struktur möglichst lange beibehalten. Die Faltungsmechanismen und die Grundlagen der konformationellen Stabilität von Proteinen zu verstehen, ist daher eines der zentralen Ziele der biophysikalischen und biochemischen Forschung. Im Mittelpunkt dieser Arbeit stand das Gen-3-Protein des Phagen fd. Sein Faltungsmechanismus ist aufs Engste mit seiner biologischen Funktion verknüpft, und es ist ein Modellsystem für die Untersuchung von Proteinfaltung, -stabilität und Prolylisomerisierung. Die isolierte N2-Domäne des Gen-3-Proteins im Mittelpunkt der Arbeit. Dabei zeigte sich, dass in der nativen N2-Domäne ein cis/trans-Gleichgewicht an Pro161 existiert, das entscheidend für die Stabilität und Faltung des Proteins ist. Solche Heterogenitäten an Prolinresten werden als potentiell wichtige regulatorische Schalter in biologischen Systemen diskutiert, konnten aber bislang kaum untersucht werden. Während der Faltung von N2 wird der cis-Anteil an Pro161 von 7 % im denaturierten Protein auf 89 % im nativen Protein erhöht, was einem Energieaufwand von 10 kJ mol-1, der Hälfte der insgesamt verfügbaren Konformationsenergie des nativen Protein, entspricht. Um diese Kopplung auf molekularer Ebene zu verstehen, wurde die lokale Sequenzumgebung von Pro161 systematisch variiert. In der cis-Form zeigte die Schleife um Pro161 eine definierte native Konformation. Die energetische Kopplung zwischen der cis-Form an Pro161 und den Faltblattsträngen ist dabei schon im Übergangszustand der Faltung voll ausgebildet. In der trans-Form hingegen ist die Schleife entfaltet, und es besteht keine energetische Kopplung mit dem Beta-Faltblatt. Die Beiträge der einzelnen Bereiche der N2-Domäne zur Struktur und zur Energetik des Übergangszustands der Faltung wurde mit Hilfe einer Phi-Wert-Analyse analysiert. Es sind zwar fast alle Bereiche für die Stabilität des nativen Proteins wichtig, den Faltungsprozeß hingegen bestimmt nur ein eng begrenzter Faltungsnukleus. Die trans-cis-Isomerisierung an Pro161 in der N2-Domäne lässt sich sehr gut durch Prolylisomerasen katalysieren. Um die Substratspezifität von Prolylisomerasen der FKBP-Familie untersuchen zu können, wurde eine Bibliothek von N2-Varianten mit allen natürlichen Aminosäuren vor Pro161 hergestellt. Prolylisomerasen, die nur aus einer katalytischen Domäne bestehen, zeigen für kurze Peptide und für faltende Proteine die gleiche Substratspezifität, mit einer sehr starken Präferenz für hydrophobe Reste vor Prolin. Besitzen die Prolylisomerasen zusätzlich eine Chaperondomäne, wie SlyD oder Triggerfaktor, dann ist ihre Aktivität praktisch unabhängig von der Aminosäure vor Prolin. Der Grund dafür ist, dass die enzymkinetischen Parameter der katalysierten Faltung, die Affinität und die Umsatzzahl durch die Chaperondomäne bestimmt werden. Die N2-Domäne besitzt nur eine marginale Stabilität. Deshalb wurde mit diesem Protein untersucht, inwieweit Proteine durch rationales consensus design von Beta-Turns stabilisiert werden können. Für N2 konnte durch Sequenzoptimierung von drei Beta-Turns die Stabilität tatsächlich praktisch verdoppelt werden, was die generelle Anwendbarkeit dieser Methode verdeutlicht. Interessanterweise führt diese Turnoptimierung auch zu einer sehr starken Beschleunigung der Faltung von N2, offensichtlich weil diese Beta-Turns bereits sehr früh im Faltungsprozess von Proteinen wichtig sind, da sie Bildung von nativen Interaktionen in den benachbarten Bereichen ermöglichen. Im Gen-3-Protein des Phagen fd tritt während der in-vitro-Faltung ein langlebiges Intermediat mit einem trans-Prolin213 auf. Mittels NMR-Spektroskopie wurde herausgefunden, das in diesem Intermediat die N1- und die N2-Domäne bereits ihre native chemische Verschiebung zeigen, aber die Gelenkdomäne zwischen den Domänen nur teilweise strukturiert ist. In der anschließenden Domänenassemblierungsreaktion werden als Folge der trans-cis Isomerisierung an Pro213 besonders Wasserstoffbrückenbindungen stark stabilisiert, die eine Kette zwischen der Grenzfläche von N1 und der Gelenkregion bilden. Die Ergebnisse zur Kopplung zwischen cis/trans Isomeren an Pro213 entsprechen konzeptionell dem Mechanismus an Pro161 in der N2-Domäne. Am Beispiel des Gen-3-Proteins des Phagen IKe wurde untersucht, ob alle Gen-3-Proteine filamentöser Phagen eine ähnliche Struktur und Faltungsmechanismus besitzen. Dabei zeigte sich, dass die TolA-bindenden Domänen beider Proteine strukturell und funktionell stark konserviert sind. Die jeweiligen pilusbindenden Domänen sind dagegen architektonisch komplett verschieden, da sie spezifisch an den jeweiligen Wirt adaptiert wurden. Deshalb sind vermutlich die Faltungsmechanismen dieser Mehrdomänenproteine, und damit auch die Infektionsmechanismen grundlegend verschieden.
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