Analyse der physiologischen Funktion von Mitgliedern der Rieske-Typ Eisen-Schwefel-Proteinfamilie in der inneren Plastidenhülle
Höher entwickelte Pflanzen enthalten eine Superfamilie von non-Häm Oxygenasen, deren Mitglieder über identische, konservierte Rieske- und mononukleare Fe-Bindungsdomänen verfügen. Diese Familie umfasst Tic55, PAO, CAO, CMO und ein 52 kDa schweres Protein (PTC52), welches in Assoziation mit dem Präkursor NADPH:Protochlorophyllid (Pchlid) Oxidoreduktase A (pPORA) Translocon vorliegt. Die Expression von AtCAO cDNA in Synechocystis, welches kein CAO-Gen enthält, führte zur Bildung von Chlorophyll b (Chl b) und geringen Mengen an Pchlid b. Pulse labeling Experimente mit dem isolierten PTC-Komplex und dem Pchlid Präkursor 5-Aminolävulinsäure (5-ALA) zeigten, dass PTC52 als Pchlid a Oxygenase agiert. Die gekoppelte in vitro Transkription/Translation von Arabidopsis CAO (AtCAO) bzw. PTC52 (AtPTC52) cDNAs führte zur Bildung von katalytisch aktiven Proteinen, wobei CAO Chlid a in Chlid b umwandelte, wohingegen PTC52 die Umwandlung von Pchlid a zu Pchlid b katalysierte. In Kotyledonen von Gerste und Arabidopsis ist der Import von pPORA von Pchlid abhängig. Während der Membran-Passage interagiert pPORA mit Komponenten des PTC-Komplexes und bildet dabei sog. „junction“-Komplexe zwischen äußerer und innerer Plastidenhülle. CAO wird als größeres Präkursor-Protein synthetisiert, über den Standard-Import-Komplex in den Intermembran-Raum importiert und liegt in seiner prozessierten Form als intrinsisches Protein der Thylakoid-Membranen bzw. der inneren Plastidenhülle vor, wo es mit Tic40, Tic22 und Tic20 interagiert und einen neuen Tic-Subkomplex bildet. Weitere Analysen mit Chloroplasten der Chlorina Mutanten ch1-3 (kein funktionelles CAO-Gen; keine Akkumulation von Chl b bzw. LHC-Proteinen) zeigten keinen Import von pLhcb1 (= Präkursor des LHCII-Apoproteins) bzw. pLhcb4 (= Präkursor des CP29-Apoproteins). PTC52 wird als größeres, ca. 57 kDa schweres Vorstufenprotein synthetisiert, in Chloroplasten importiert und zur endgültigen Größe prozessiert. Das reife, 52 kDa schwere Protein wurde als intrinsisches Membranprotein der inneren Plastidenhülle identifiziert, wo es mit PTC130, PTC90, PTC16/Oep16 und PTC33/Toc33 interagiert und einen funktionellen Protein-Import-Komplex (PTC-Komplex) bildet. Während des substratabhängigen Imports von pPORA katalysiert PTC52 die Oxygenierung von Pchlid a zu Pchlid b. DEPC agiert, indem es konservierte His-Reste im Rieske-Fe-S-Cluster ethoxyformyliert. Während bei geringen DEPC-Konzentrationen allein der Import von pPORA inhibiert war, war dieser in Anwesenheit von 1 mM DEPC nicht nachweisbar, wohingegen die Translokation von Tic55-Import-Substraten um ca. 10 % verringert war. Dies bestätigte die Beteiligung der His-Reste am katalytischen Mechanismus von PTC52 und Teil des PTC-Komplexes. Anhand von zwei PTC52-knockout-Linien (SALK_011945 und SAIL_148.HC5) wurde gezeigt, dass loss-of-function-Mutationen im Arabidopsis PTC52-Gen zu einem embryoletalen Phänotyp führten, so dass heterozygote AtPTC52/Atptc52-Pflanzen zur Analyse der Bedeutung von PTC52 in planta herangezogen wurden. Diese Keimlinge waren empfindlicher gegenüber einer Belichtung, was durch die geringeren Mengen an „light-harvesting“ POR-Pchlid (LHPP) – Komplexen im Prolamellarkörper der Etioplasten erklärbar war. Durch Pigmentanalysen konnte sowohl Pchlid a als auch Pchlid b in Wildtyp-Keimlingen identifiziert werden, wobei deren relative Anteile in AtPTC52/Atptc52-Pflanzen in Richtung Pchlid a verschoben waren. Zusätzlich waren ein Rückgang der Chl-Akkumulation, ein verändertes Chl b/Chl a-Verhältnis und eine Verringerung der LHCII-Mengen während des frühen Ergrünens erkennbar. Mittels Affinitätschromatographie wurden Tic55, PTC52 und PAO als Thioredoxin (Trx)-Targets in der inneren Plastidenhülle identifiziert. Abgesehen von konservierten Rieske- und [2Fe-2S]-Clustern weisen diese Proteine ein CxxC-Motiv auf. Aktivitätsmessungen in An- bzw. Abwesenheit von stromalem Trx f bzw. Trx m lassen darauf schließen, dass PTC52 und PAO aus Gerste reversiblen Oxidations/Reduktionsvorgängen, vermittelt durch redox-aktive SH-Gruppen, unterliegen, wobei die reduzierte Form eine höhere Aktivität aufweist. Um zu verifizieren, ob Trx die Aktivität von Tic55, PTC52 und PAO als Reaktion auf die Licht-Dunkel-Regulation und/oder oxidativen Stress regulieren könnte, verglichen wir die In-Vitro-Import-Kapazitäten der verschiedenen Import-Komplexe in tigrina d12 – Chloroplasten, die aus Pflanzen stammten, die entweder unter kontinuierlichem Weiß-Licht angezogen oder vor der Plastiden-Isolierung verdunkelt bzw. einem Dunkel-Licht-Shift unterworfen worden waren. Tic55, PTC52 und PAO reagierten sensitiv gegenüber einer oxidativen Kontrolle und waren in wiederbelichteten tigrina d12 – Pflanzen inaktiv. In CAO ist kein CxxC-Motiv vorhanden, so dass CAO weder auf das Thioredoxin-System noch auf oxidativen Stress reagiert.
Networked Digital Library of Theses and Dissertations