Von der Faltung zur Funktion: Steuerung des Infektionsmechanismus filamentöser Phagen durch Faltungsprozesse und Beschleunigung oxidativer Faltung durch Thioloxidasen
Die filamentösen Phagen IF1 und fd sind eng miteinander verwandt. Dies spiegelt sich auch bei der Infektion von E. coli Zellen wider, die bei beiden Phagen nach einem Zweischrittmechanismus abläuft, der durch die jeweiligen Gen-3-Proteine (G3P) vermittelt wird. Im ersten Schritt bindet die N2 Domäne von G3P an den bakteriellen Pilus, beim Phagen IF1 an den I Pilus, beim Phagen fd an den F Pilus. Durch die spezifische Bindung an einen Pilus bestimmt die N2 Domäne von G3P die Wirtsspezifität des Phagen. Im zweiten Schritt der Infektion interagiert in beiden Fällen die N1 Domäne mit dem bakteriellen Rezeptor TolA-C. Die N1 Domänen der G3Ps beider Phagen binden mit demselben Bindungsmuster an die gleiche Stelle von TolA C, wie die Röntgenstrukturanalyse der beiden Komplexe zeigt. Der molekulare Mechanismus der Infektion unterscheidet sich, da die G3Ps der Phagen IF1 und fd eine verschiedenartige Domänenorganisation besitzen. Im G3P des Phagen IF1 stellen N1 und N2 zwei eigenständige und stabile Einheiten dar, die Bindungsstellen für den I Pilus und TolA-C sind daher permanent zugänglich. Das native G3P des Phagen fd liegt dagegen in einer geschlossenen, inaktiven Konformation vor, in der N1 und N2 fest miteinander assoziiert sind und die Bindungsfläche für TolA-C auf N1 in der Grenzfläche zwischen N1 und N2 verborgen ist. Erst die Bindung von N2 an den bakteriellen F Pilus führt zur Domänendissoziation, wodurch die Bindungsstelle für TolA C auf N1 zugänglich wird. Dieser komplexe Infektionsmechanismus des Phagen fd konnte in den einfacheren Infektionsmechanismus des Phagen IF1 überführt werden, indem die Domäneninteraktion durch die Deletion von sieben Aminosäuren im Gelenkbereich zwischen N1 und N2 aufgelöst wurde. Eine Erhöhung der Infektionsraten auf das Niveau des Referenzphagen fd wurde durch eine nachträgliche selektive Stabilisierung der N2 Domäne erreicht. Die Phagen fd und IF1 entwickelten unterschiedliche Strategien um Infektiosität und eine hohe thermodynamische Stabilität der G3Ps zu vereinen. In IF1 G3P bildeten sich zwei eigenständige, stabile Domänen aus, in fd G3P hingegen etablierte sich eine geschlossene Konformation, in der die labile N2 Domäne durch eine starke Assoziation mit der N1 Domäne stabilisiert wird. Die Notwendigkeit der Domänendissoziation in G3P während der Infektion durch den Phagen fd wurde durch die Konstruktion eines G3Ps nachgewiesen, in dem N1 und N2 durch eine Disulfidbrücke kovalent miteinander verknüpft sind. Diese Verknüpfung verhindert die Domänendissoziation und folglich die Infektion. Das Phagenkonstrukt mit dieser G3P Variante als Vermittler der Infektion ermöglicht eine steuerbare Infektion, die durch Reduktion der Disulfidbrücke induziert werden kann. Die Konstruktion von Disulfidbrücken wurde ebenfalls benutzt, um die Chaperondomäne der Peptidyl-Prolylisomerase SlpA zu stabilisieren. In weitergehenden Untersuchungen werden die Disulfidbrücken in das Volllängenprotein SlpA eingebaut, um die Auswirkung dieser entropischen Stabilisierung auf Funktion und Stabilität des Zweidomänenproteins analysieren zu können. Die Chaperondomäne der Peptidyl-Prolylisomerase SlyD, die in isolierter Form ungefaltet vorliegt, konnte ebenfalls durch den Einbau einer Disulfidbrücke stabilisiert werden. Die konformationelle Faltung dieser stabilisierten Variante ist strikt an die Ausbildung der Disulfidbrücke gekoppelt. Daher eignet sich dieses Protein hervorragend als Substrat, um die Beschleunigung der oxidativen Faltung durch Thioloxidasen zu charakterisieren. Die Effizienz der Katalyse der oxidativen Faltung korreliert dabei nicht mit dem Reduktionspotential der Faltungshelfer, sondern mit der Fähigkeit nicht-native Substratproteine über hydrophobe Bindungsflächen, hier Chaperondomänen, zu binden. Die Bindung nicht-nativer Substrate über Chaperondomänen, sowie ein geeignetes Reduktionspotential des katalytischen Disulfids, sind ebenfalls Voraussetzungen für eine Disulfidisomeraseaktivität von Faltungshelfern. Deshalb besitzen PDI und DsbC neben einer hohen Thioloxidaseaktivität auch eine hohe Disulfidisomeraseaktivität. Für diese Untersuchungen wurde ein sensitiver Test auf Grundlage der Reaktivierung fehlgefalteter RNase T1 und der Hydrolyse von Fluorophor-markierten Oligonukleotiden etabliert und zur Analyse von PDI, DsbC und DsbA eingesetzt. Mia40 ist eine neuartige Thioloxidase im Intermembranraum von Mitochondrien. Für Mia40 konnte die Kristallstruktur mit einer Auflösung von 2,3 Å gelöst werden. Mia40 zeigt keine strukturelle Ähnlichkeit zu bekannten Thioloxidasen. Wie viele andere Faltungshelfer wirkt Mia40 als Chaperon, in vitro verhindert es effektiv die Aggregation rückfaltender Citratsynthase. Mia40 zeigt in vitro lediglich Oxidase-, aber keine Disulfidisomeraseaktivität. Ob Mia40 in vivo ausschließlich als Thioloxidase wirkt, oder bei speziellen Substraten doch fehlerhafte Disulfidbrücken auflösen kann, ist noch unklar und Gegenstand weiterführender Forschungsarbeiten.
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