Etablierung von Methoden zur Bioevaluation antitumoraler Naturstoffe, Metabolite und Analoga
Die Ziele, die ich mir vor Beginn meiner Arbeit gesteckt habe (siehe 1.3), wurden weitestgehend erreicht. Es wurde ein Verfahren entwickelt, mit dessen Hilfe Illudin M 11 zuverlässig gewonnen werden kann. Die Aufzucht von O. olearius im Medium HA- und die Extraktion nach Kutscher-Steudel erwiesen sich hierbei als Methoden der Wahl. Illudin S 11a konnte jedoch nicht isoliert werden. Daneben konnte eine Reihe von Verfahren zur Evaluierung von Testsubstanzen etabliert werden. Die Untersuchungen der Substanzeigenschaften (siehe 2.5 bis 2.8) lieferten nützliche und verlässliche Ergebnisse, auch wenn man hinsichtlich des Einsatzbereiches manchmal Einschränkungen in Kauf nehmen musste. Die Stabilität von Esterbindungen wurde auf zwei Arten untersucht. Die getesteten Substanzen 16c, 18 und 19b erwiesen sich hierbei als weitestgehend stabil gegenüber Hydrolyse (siehe 3.2). Die Methode, die zur Untersuchung der Komplexbildung eingesetzt wurde, lässt sich nicht auf alle Verbindungen übertragen, sondern nur auf solche, deren Komplexe ein Absorptionsmaximum im sichtbaren Bereich besitzen (siehe 3.3). Bei den Eisenkomplexen war das Potential der getesteten Liganden, Komplexe zu bilden vergleichbar mit dem von EDTA. Bei den anderen getesteten Kationen war dieses schwächer ausgeprägt. Im Rahmen des Glutathion-Monitorings wurde festgestellt, dass – im Gegensatz zur Muttersubstanz 11 – keines der getesteten Illudinderivate 27 eine spontane Reaktion mit GSH eingeht (siehe 3.4). Der Alkylierungsassay mit Aceton liefert nur für farblose Verbindungen verlässliche Ergebnisse. Bei den getesteten Illudinderivaten 27 konnte zwar ein Alkylierungspotential gemessen werden, doch stellt deren vorhandene Eigenabsorption einen gewissen Unsicherheitsfaktor dar. Der Alkylierungsassay mit Acetophenon lieferte keine verwertbaren Ergebnisse (siehe 3.5). Die zellbasierten Analysen (siehe 2.9 bis 2.11) sowie der CAM-Assay (siehe 2.12) sind für alle Stoffe durchführbar. Auch wenn die untersuchten Organismen (Zellen und Embryonen) nicht immer auf die gleiche Weise reagieren, kommen auch hierbei verlässliche Resultate zu Stande. Da die Zahl der durchführbaren Tests durch Kosten und Verfügbarkeit der Untersuchungsobjekte limitiert ist, wurde hinsichtlich der Testsubstanzen immer eine Vorauswahl getroffen. Beim TUNEL-Test zeigten die meisten Verbindungen ein proapoptotisches Verhalten, besonders gut wirkten die Illudinderivate 27 (siehe 3.6). Der Annexin-Test ist nur bedingt aussagekräftig. Er ließ sich zum einen nur mit Suspensionszellen durchführen, zum anderen war es manchmal kaum möglich, spätapoptotische von nekrotischen Zellen zu unterscheiden (siehe 3.7). Mit Hilfe von Immunoblots wollte man Rückschlüsse hinsichtlich des Mechanismus der Apoptoseinitiierung ziehen. Die schnelle Prozessierung der Caspase 9 legt den Schluß nahe, dass die Platinkomplexkonjugate 13 (HL 60), die Oxazole 26 (Kb-V1), die Illudinderivate 27 (HL 60 und 518 A2) und die Chalkone 20, 21a und 21c (HL 60) zu einer Aktivierung über den mitochondrialen Weg führen. Die anderen Testverbindungen bedürfen weiterer Untersuchungen in Bezug auf den Signalweg der Apoptoseinitiierung (siehe 3.8). Einige Derivate der antivaskulären Verbindung Combretastatin A-4 7a wurden mit Hilfe des CAM-Assays untersucht. Die meisten zeigten hierbei erwartungsgemäß ein vergleichbares Verhalten. Besonders interessant ist der Aktivitätsunterschied der Combretastatin-Analoga 26h und 26i. Dieser wurde sowohl beim TUNEL-Test als auch beim CAM-Assay beobachtet, obwohl sich beide Verbindungen strukturell kaum unterscheiden.
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