Zentrale Cis- und Transregulation der pflanzlichen Hypoxieantwort

Pflanzen sind obligat aerobe Organismen mit einer sessilen Lebensweise. Aus diesen Gründen ist die Fitness von Pflanzen von der lokalen Sauerstoffverfügbarkeit abhängig. Sinkt die intrazelluläre Sauerstoffkonzentration (Hypoxie), zum Beispiel nach starken Regenfällen, während Staunässe oder Überflutung unter den Km-Wert der Cytochrom-c-Oxidase, erfährt die Pflanze eine Energiekrise durch ATP-Mangel. Um dem entgegenzuwirken, haben Pflanzen Merkmale entwickelt, die die Verfügbarkeit von Sauerstoff entweder erhöhen, oder dessen Verbrauch herabsetzen. Dem größten Teil solcher induzierbaren morphologischen und metabolischen Remodellierungen liegt eine differenzielle Genregulation zugrunde. Die zentrale Hypoxieantwort von Arabidopsis thaliana wird durch eine systemische Induktion von 49 core Genen, darunter ALCOHOL DEHYDROGENASE 1 (ADH1), PYRUVAT DECARBOXYLASE 1 (PDC1), LOB DOMAIN-CONTAINING PROTEIN 41 (LBD41), HYPOXIA RESPONSE ATTENUATOR 1 (HRA1), PLANT CYSTEINE OXIDASE 1 (PCO1) und PCO2 definiert. Etwa 50 % dieser Gene sind Ziele von group VII-ERF Transkriptionsfaktoren, von welchen in Arabidopsis thaliana mindestens fünf Mitglieder vorkommen. HYPOXIA RESPONSIVE ERF 1 (HRE1) und HRE2 werden unter Hypoxiebedingungen transkriptionell aktiviert, während RELATED TO AP2 2 (RAP2.2), RAP2.3 und RAP2.12 konstitutiv aktiviert vorliegen. Alle group VII-ERFs von Arabidopsis thaliana werden posttranslational durch einen Zweig des N-end-rule Pathways (NERP) sauerstoffabhängig destabilisiert, während Sauerstoffmangel deren Transaktivität über eine nukleare Akkumulation auslöst. Die Redundanz von group VII-ERFs wurde vorher auf den Ebenen der Hypoxieanfälligkeit und Genregulation untersucht. Dennoch sind der quantitative Einfluss jedes Mitglieds, der zugrundeliegende Mechanismus der Redundanz und mögliche Hierarchien unter group VII-ERFs nicht ausreichend verstanden. Bei Wiederbelüftung kommt es zu einer posthypoxischen Abnahme der mRNA von group VII-ERF Zielgenen, welche als ebenso überlebensnotwendig angesehen wird, wie deren anfängliche Hypoxieinduktion. Da RAP2.12 länger im Nukleus residiert als die mRNA seiner Zielgene, wird von einem aktiven Repressionsmechanismus ausgegangen, welcher nicht allein durch das Wirken des Repressors HRA1 erklärt werden kann. Die Basis der vorliegenden Arbeit war die Isolation von Promotoren von Hypoxiemarkergenen. Der LBD41-Promotor, welcher in einer NERP-Mutante und unter Hypoxie aktiv war, wurde für ein Screening nach Transregulatoren der Hypoxieantwort genutzt. Dabei wurden zum einen group VII-ERFs als Aktivatoren der Hypoxieantwort bestätigt, und ein bis dahin noch unbekannter positiver Einfluss von RAP2.3 auf die Hypoxieinduktion entdeckt. Zum anderen wurden potenzielle Repressoren identifiziert, welche im ersten Teil dieser Arbeit genauer untersucht wurden. Dem REDOX RESPONSIVE TRANSCRIPTION FACTOR 1 konnte durch transiente Überexpression und knock out Analysen keine Funktion für die Regulation unter Sauerstoffmangel zugeschrieben werden. KANADI1 und ZINC FINGER PROTEIN 1 waren in der Lage, hypoxieresponsive Promotoren, wahrscheinlich jedoch unspezifisch, zu reprimieren. Mitglieder der Constans-like Familie enthüllten hingegen eine redundante Repressorfunktion, spezifisch für hypoxieresponsive Promotoren. LBD41 zeigte ebenso hypoxiespezifische Repressoreigenschaften, welche, im Gegensatz zu denen von HRA1, wahrscheinlich nicht auf einer Interaktion mit group VII-ERFs beruhten. Die Resequenzierung von Effektorkonstrukten enthüllte die Existenz eines kodierenden group VII-ERF Gens, welches starke Ähnlichkeiten zu RAP2.3 aufwies, jedoch nicht identisch mit diesem war. Genotypisierungsexperimente deuteten darauf hin, dass es sich bei diesem Gen um eine allelische Variante von RAP2.3 handelte, welche in manchen Ökotypen auftauchte. Überraschenderweise enthielten diese Ökotypen zusätzlich eine kodierende, intronfreie RAP2.3 Version, welche möglicherweise ein funktionales prozessiertes Pseudogen darstellte. Die funktionelle Redundanz von konstitutiv aktiven group VII-ERFs wurde mittels ADH-Aktivitätsmessung in stabilen Überexpressionslinien bestätigt. Mittels quantitativer realtime PCR (qRT-PCR)- Analysen mit Einzel- und Doppelnullallelen von RAP2.2 und RAP2.12 wurden beide als gleichrangige Hauptaktivatoren der Hypoxieantwort charakterisiert. Eine minimale Restexpression von Hypoxiemarkergenen bei Abwesenheit von RAP2.2 und RAP2.12 ließ auf eine physiologisch relevante Beteiligung von RAP2.3 schließen. Die Messung der Überflutungsanfälligkeit von rap2.2/2.12 Mutanten wurde durch natürliche Schwankungen der Überlebensrate eingekreuzter Ökotypen erschwert. RAP2.2 wurde im weiteren Verlauf als hypoxiespezifischer transkriptioneller Aktivator charakterisiert. Mittels induzierter nuklearer Akkumulation eines RAP2.2-Fusionsproteins konnten direkte Zielgene des Transkriptionsfaktors identifiziert werden. Mittels Deletionskartierung von Promotoren direkter RAP2.2-Zielgene wurde eine 33 bp lange, positiv regulatorische Sequenz isoliert, welche durch RAP2.2, RAP2.3 und RAP2.12, sowie unter Hypoxie aktiviert wurde. Mithilfe einer neu etablierten Strategie, welche klassische und phylogenetische Motivvorhersagen kombinierte, wurde ein konserviertes Motiv identifiziert. Dieses war sowohl in der 33bp langen Sequenz, als auch in nativen Promotoren funktional, was durch Transaktivierungsexperimente mit punktmutierten und deletierten Sequenzen nachgewiesen wurde. Das Motiv wies Sequenzähnlichkeiten zum Anaerobic Responsive Element auf, was sich unter anderem durch eine gemeinsame, direkte Interaktion mit group VII-ERFs in einem Hefe-1-Hybridsystem, auf funktionaler Ebene widerspiegelte. Es wurde deshalb als ARE-like element (ALE) bezeichnet.

Level thesis:degree_level

thesis.doctoral

Grantor dc:publisher

Universität Bayreuth

Year

2015

Author dc:creator

• Gasch, Philipp

Contributors dc:contributor

• Mustroph, Angelika

Repository record source_url

https://epub.uni-bayreuth.de/id/eprint/2180/

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oai:epub.uni-bayreuth.de:2180