Analyse des meiotischen Cohesinkomplexes in Drosophila melanogaster-Weibchen
Für die Aufrechterhaltung der genetischen Stabilität ist es von entscheidender Bedeutung, dass die gesamte genetische Information nach einer Zellteilung gleichmäßig auf die entstandenen Tochterzellen aufgeteilt wird. Während der S-Phase wird die DNA repliziert, sodass zwei identische Kopien vorliegen, welche bis zum Ende der Mitose miteinander verbunden bleiben. Hierfür wird der ringförmige Cohesinkomplex benötigt, der die DNA topologisch umschließt. Dieser Multiproteinkomplex setzt sich aus vier Kernuntereinheiten zusammen: SMC1, SMC3 und den zwei nicht-SMC Untereinheiten Scc1/Rad21/Mcd1 und Scc3/SA. In Metazoen wird der Großteil der Cohesinmoleküle während der Prophase vom Chromatin entfernt, während ein kleiner Teil am zentromerischen Chromatin verbleibt und erst beim Metaphase-Anaphase-Übergang durch eine Separase-abhängige Spaltung von Scc1/Rad21/Mcd1 abgelöst wird. Dieser exakt regulierte Mechanismus ist die Grundlage für eine korrekte Segregation und Aufteilung der Schwesterchromatiden auf die entstehenden Tochterzellen. Die Meiose stellt eine spezielle Art der Zellteilung dar, bei der zwei aufeinanderfolgende Teilungen durchlaufen werden, ohne eine dazwischen stattfindende DNA-Replikation. Dies hat die Reduktion des Chromosomengehalts zur Folge. Zur Aufrechterhaltung der Schwesterchromatidkohäsion wird ein Meiose-spezifischer Cohesinkomplex benötigt, welcher anstatt Scc1 die Meiose-spezifische Untereinheit Rec8 besitzt. Das an den Chromo-somenarmen befindliche Cohesin wird in Meiose I durch einen Separase-abhängigen Prozess gespalten und die zentromerische Fraktion wird erst beim Durchlaufen von Meiose II vom Chromatin abgelöst. Dieser genau regulierte Prozess ist die Voraussetzung für die Bildung von Gameten mit einem korrekten Chromosomensatz. Rec8 und Scc1/Rad21/Mcd1 gehören zur Proteinfamilie der Kleisine. Diese Proteine verbrücken die Kopfdomänen der SMC-Proteine und sind bereits in verschiedenen Organismen beschrieben worden, jedoch konnte in Drosophila bisher kein Rec8-Homolog identifiziert werden. Daran anknüpfend wurde im ersten Teil der Arbeit untersucht, inwiefern die mitotische Cohesinuntereinheit Rad21 eine Funktion bei der Aufrechterhaltung der meiotischen Kohäsion besitzt und welche Folgen der Oogenese-spezifische Abbau dieses Proteins auf die Struktur des Synapto-nemalen Komplexes (SC) hat. Dieser Komplex stellt ein Proteingerüst dar, welcher die Paarung und anschließende Rekombination der homologen Chromosomen ermöglicht. Die Oogenese-abhängige Inaktivierung von Rad21 hatte keine Beeinträchtigung der Chromosomensegregation zur Folge, sehr wohl jedoch Auswirkungen auf die Struktur des SCs, indem dessen Stabilität negativ beeinflusst wird. Durch in vitro Interaktionsstudien konnte darüber hinaus ein Hinweis für eine direkte Interaktion von Rad21 mit C(2)M, einer Komponente des lateralen Elements des SCs, erbracht werden. Diese Assoziation ist eventuell auch von entscheidender Bedeutung für die Stabilität des SCs. Um auszuschließen, dass das Ausbleiben von meiotischen Defekten nach ektopischer Proteolyse von Rad21 nicht auf eine unvollständige Inaktivierung der Cohesinuntereinheit zurückzuführen ist, wurde eine Rad21-Version generiert, bei der die Separaseerkennungs-sequenzen mutiert waren. Nach Oogenese-spezifischer Expression dieser nicht-spaltbaren Rad21-Variante konnte ebenfalls keine Beeinträchtigung der Chromosomensegregation festgestellt werden, sodass anzunehmen ist, dass Rad21 keine bzw. nur eine unter-geordnete kohäsive Funktion in der weiblichen Meiose von Drosophila melanogaster innehat. Im zweiten Teil der Arbeit wurden Funktionsanalysen eines weiteren Proteins (SOLO; sisters-on-the-loose) durchgeführt, für das bereits kohäsive Funktionen während der Meiose beschrieben wurden. Um zu testen, ob dieses Protein als funktionelles Rec8-Homolog fungieren könnte, wurden verschiedene Interaktionsstudien durchgeführt. Diese legten jedoch nahe, dass SOLO vermutlich kein integraler Bestandteil eines meiotischen Cohesin-komplexes ist, sondern vielmehr als regulatorisches Protein fungiert. Auch die Expression einer SOLO-Version, bei der die vermuteten Separase-Spaltstellen modifiziert wurden, hatte keinen Einfluss auf den Verlauf der Meiose, sodass auch dieses Kriterium für ein kohäsives Kleisinprotein nicht erfüllt ist. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass POLO-spezifische Phosphorylierungen im mittleren Teil des Proteins für die Rekrutierung von SOLO entlang der Chromosomen cores benötigt werden. Durch den Austausch mutmaßlich phosphorylierter Serin/Threonin-Reste gegen Alanine wurde das Level an SOLO in diesen Bereichen deutlich reduziert, was Auswirkungen auf die Paarung und Synapsis der homologen Chromosomen hatte. Mit Hilfe von 2-Hybridinteraktionsstudien in der Hefe konnten darüber hinaus auch noch Wechselwirkungen von SOLO mit verschiedenen Cohesin-assoziierten Proteinen, wie zum Beispiel dem Cohesinladeprotein Nipped-B/Scc2, Sororin/Dalmatian, SUNN und Pds5 nachgewiesen werden, deren Relevanz in initialen Experimenten in der weiblichen Meiose von Drosophila melanogaster bestätigt wurden. Zusammenfassend kann demnach festgehalten werden, dass SOLO vermutlich als regulatorisches Protein im Kontext mit verschiedenen Cohesin-assoziierten Proteinen (Pds5, Sororin, SUNN, Nipped-B) für die Schwesterchromatidkohäsion in der weiblichen Meiose und die Stabilität des SCs benötigt wird, nicht jedoch als Rec8-Homolog fungiert.
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