Modifizierung und Prozessierung des rekombinanten Spinnenseidenproteins eADF4(C16) zur Steuerung der Interaktion zwischen Zellen und Seidenfilmen

Natürliche Spinnenseide wurde über Millionen Jahre durch Evolution effektiv für ihre Funktion optimiert und weist eine Zähigkeit auf, welche derzeit von keinem anderen natürlichen oder synthetischen Material erreicht werden kann. Zusätzlich ist Spinnenseide schon seit Jahrhunderten für ihre gute Biokompatibilität und Bioabbaubarkeit bekannt und wurde deshalb schon in der Antike von Menschen als Wundauflage erfolgreich eingesetzt. Auch heutzutage ist durch die rekombinante Produktion von Spinnenseidenproteinen ein Einsatz als vielfältiges Biomaterial möglich. Durch Prozessierung in unterschiedliche Morphologien, sind neben der Verwendung als Hochleistungsfaser auch biomedizinische Applikationen wie gezielter Wirkstofftransport, Implantatbeschichtungen oder Wundauflagen realisierbar. In der vorliegenden Dissertation wurde mit Filmen aus dem rekombinanten Spinnenseidenprotein eADF4(C16) und Varianten davon gearbeitet. Die Proteine basieren dabei auf der Konsensussequenz der repetitiven Kerndomäne des Dragline‐Seidenproteins ADF4 (A. diadematus Fibroin 4) der europäischen Gartenkreuzspinne (A. diadematus) und können biotechnologisch effizient hergestellt werden. Aufgrund der geringen Interaktion zwischen Zellen und nicht modifizierten glatten Seidenfilmen, ist eADF4(C16) als Beschichtung für Katheder, Stents oder Silikonbrustimplantate, bei denen Zelladhäsion nicht erwünscht ist, gut geeignet. Im Hinblick auf andere Einsatzbereiche (z.B. Geweberegeneration) ist eine ausreichende Wechselwirkung zwischen Material und Zellen der umgebenden Matrix für den Erfolg des Implantats essentiell. Da Zelladhäsion generell durch unspezifische Interaktionen (z.B. Topographie, Benetzbarkeit oder Ladung) aber auch durch spezifische Motive vermittelt werden kann, wurde als erstes ein minimales Erkennungsmotiv für Integrine (RGD) an das Seidenprotein gekoppelt. Zum einem wurde mittels molekularbiologischer Methoden eine lineare RGD Sequenz (GRGDSPG) in eADF4(C16) eingeführt, zum anderen konnte eine Cystein beinhaltende Variante (ntagCysC16) erfolgreich mit einem cyclischen RGD Peptid (c(RGDfK)) chemisch modifiziert werden. Dabei zeigten im Vergleich zu eADF4(C16) Filmen, auf RGD funktionalisierten Seidenfilmen kultivierte BALB/3T3 Fibroblasten eine signifikantbessere Adhäsion und schnellere Proliferation. Die Zellbindungsaktivität der linearen RGD‐Sequenz (genetisch modifiziert) war dabei nicht von der des Cyclopeptids (chemisch gekoppelt) zu unterscheiden. Einer der Gründe für die verminderte Fibroblasten Adhäsion auf eADF4(C16) Filmen ist die geringe Rauigkeit der Filmoberfläche und die damit verbundene Verhinderung von physikalischen Verankerungen der Zellen. Deshalb wurde im zweiten Teil der Dissertation durch Änderung der physikochemischen Eigenschaften von Seidenfilmen Einfluss auf die unspezifischen Interaktionen zwischen Zellen und Material genommen. Zur Einführung einer Oberflächentopographie wurden mittels Mikroabformung in Kapillaren (micro‐molding in capillaries, MIMC) strukturierte Seidenfilme mit parallelen Rillen hergestellt. Im Vergleich zu glatten eADF4(C16) Filmen konnte die Zelladhäsion auf den so hergestellten Filmen signifikant erhöht werden. Durch die vorhandene Fernordnung im Mikrometerbereich konnte gleichzeitig auch die Ausrichtung der Zellen entlang des aufgebrachten Musters gesteuert werden. Um die Stabilität der Seidenfilme zu erhöhen, wurde zusätzlich zu den negativ geladenen Spinnenseidenproteinen das positiv geladene rekombinante Florfliegen Eierstiel‐Seidenprotein N[AS]8C herangezogen. Die beiden Proteintypen bildeten dabei die ideale Kombination, um mechanisch stabile strukturierte Seidenfilme herzustellen. Aufgrund der geringen Zelladhäsion auf N[AS]8C Oberflächen konnte darüber hinaus die Adhäsion und Proliferation von BALB/3T3 Fibroblasten und C2C12 Myoblasten auf die Spinnenseidenoberflächen begrenzt werden, wodurch sich die Zellen parallel zu der Rillenachse ausrichteten. Neben der Einführung einer Oberflächenstruktur in Seidenfilmen, konnte auch gezeigt werden, dass die Benetzbarkeit von eADF4(C16) Filmen individuell eingestellt werden kann. Aufgrund der amphiphilen Eigenschaften der hier verwendeten rekombinanten Spinnenseidenproteine konnte durch Änderung spezifischer Grenzflächen (Protein‐Substratoberfläche) die Benetzbarkeit von eADF4(C16) Filmen beeinflusst werden. Auf den ausgewählten hydrophoben und hydrophilen Modelloberflächen (Polytetrafluorethlyen, Polystyrol und Glas) konnte so der Wasserkontaktwinkel der Seidenfilmoberflächen, je nach verwendetem Substrat, im Bereich von 39‐113° eingestellt werden, wobei jeweils eine Umkehr der Substrat‐Hydrophobizität zu beobachten war. Des Weiteren wurde basierend auf den vorliegenden Erkenntnissen und in Anlehnung an die Mikrophasenseparation von Blockcopolymeren ein Modell zur Selbstassemblierung von eADF4(C16) auf Substraten unterschiedlicher Hydrophobizität vorgeschlagen. Insgesamt wurden unterschiedliche Möglichkeiten zur Steuerung der Zelladhäsion auf eADF4(C16) Filmen analysiert. Die Interaktion zwischen Zellen und Seidenoberflächen wurde sowohl durch Einführung spezifischer Signale als auch durch gezielte Steuerung unspezifischer Interaktionen verbessert. Seidenbeschichtungen sind somit durch ihre einstellbaren Eigenschaften, der Biokompatibilität und der Fähigkeit zur Steuerung der Zelladhäsion für diverse biologische und biomedizinische Applikationen ein vielversprechendes Biomaterial.

Level thesis:degree_level

thesis.doctoral

Grantor dc:publisher

Universität Bayreuth

Year

2015

Author dc:creator

• Wohlrab, Stefanie

Contributors dc:contributor

• Scheibel, Thomas

Repository record source_url

https://epub.uni-bayreuth.de/id/eprint/2135/

OAI identifier oai:identifier

oai:epub.uni-bayreuth.de:2135