Struktur-Funktionsbeziehungen und Inhibition retroviraler Reverser Transkriptasen

Das Enzym Reverse Transkriptase (RT) ist für den retroviralen Lebenszyklus von entscheidender Bedeutung. Die RT aus dem Humanen Immundefizienzvirus Typ 1 (HIV-1) ist ein Heterodimer bestehend aus den Untereinheiten p66 und p51. Im Gegensatz hierzu besitzen Foamy Viren (FVs) wie das Affen Foamy Virus aus Makaken (simian foamy virus of macaques, SFVmac) eine Protease (PR)-Domäne am N-Terminus des reifen monomeren PR-RT Enzyms. Alle retroviralen RTs beinhalten eine N-terminale Polymerase- und eine C-terminale Ribonuklease H (RNase H)-Domäne. Die Polymerasedomäne kann in die Handflächen-, Finger-, Daumen- und Verbindungssubdomäne unterteilt werden. Letztere verbindet die Polymerasedomäne mit der C-terminalen RNase H. Während der Reversen Transkription schreibt die RT die genomische virale RNA in doppelsträngige DNA um. Hierbei katalysiert die Polymerasedomäne die DNA-Synthese und der RNA-Strang im entstehenden RNA/DNA-Hybrid wird von der RNase H geschnitten. Damit sind beide, die RNase H- und Polymeraseaktivität für die retrovirale Vermehrung unerlässlich und stellen wichtige Angriffsziele für die antiretrovirale Therapie dar. Genaue Kenntnisse über die Grenzen und Funktionen von (Sub)-Domänen in der SFVmac PR-RT sind wichtig für strukturelle und mechanistische Studien mittels der Kernspinresonanz (Nuclear Magnetic Resonance, NMR)-Spektroskopie. Deshalb wurde der Einfluss von (Sub)-Domänendeletionen auf die strukturelle Stabilität und enzymatische Aktivität der SFVmac PR-RT untersucht. Sowohl Deletionen der RNase H-Domäne als auch der Verbindungssubdomäne beeinträchtigten beide, durch eine Abnahme der Substratbindungsaffinität oder strukturellen Stabilität, die katalytische Aktivität der Polymerasedomäne. Außerdem erwies sich die Aminosäureregion 107-143 am N-Terminus der RT ebenfalls als wichtig für die katalytische Aktivität und strukturelle Integrität der Polymerase. Die Aktivierung der viralen Protease (PR) erfolgt durch Bindung der PR-RT an das virale RNA-Motif PARM. PR-RTs bei denen die RNase H-Domäne deletiert war, waren nicht mehr zur PR-Aktivierung in der Lage. Darüber hinaus muss die proteolytische Spaltung von Gag vor der Reversen Transkription abgeschlossen sein. Azidothymidin (AZT) ist ein nukleosidischer Inhibitor, der die RT-Aktivität von HIV-1 und SFVmac in vivo und in vitro inhibiert. Die Resistenz gegen AZT basiert in beiden Viren auf einem ATP-vermittelten Ausbaumechanismus von bereits eingebautem AZT-Monophosphat (AZTMP). In der SFVmac PR-RT verleihen die vier Substitutionen K211I, I224T, S345T und E350K maximale Resistenz gegen AZT. Um die Bedeutung der einzelnen Substitutionen für den Resistenzmechanismus aufzuklären, wurden PR-RT-Varianten mit ausgewählten Kombinationen der vier Aminosäureaustausche biophysikalisch und biochemisch untersucht. Der Austausch I224T ist ein Polymorphismus mit keinem Effekt auf die AZT-Resistenz an sich. Die Substitution K211I änderte nicht nur die enzymatischen Eigenschaften der PR-RT, wie die katalytische Aktivität und Einbaugenauigkeit von Nukleotiden, sondern verdoppelte auch die Ausbaueffizienz in Anwesenheit von S345T und E350K. NMR-spektroskopische Experimente mit einer verkürzten Polymerasedomäne (RTshort), bestehend aus den Subdomänen Finger und Handfläche, zeigten keine ATP-Bindung in der Wildtyp-RTshort. Im Gegensatz hierzu war die RTshort-mt4, mit allen vier Resistenzsubstitutionen in der Lage ATP mit einem KD-Wert von etwa 7.6 mM zu binden. Dabei ist S345T die wichtigste Substitution für den AZTMP-Ausbau, da sie eine hochaffine Bindungstasche für das ATP, vermutlich infolge einer Reorientierung eines bereits vorhandenen Tryptophanrestes, erzeugt. Die RNase H-Domäne der HIV-1 RT ist ein neues Angriffsziel antiretroviraler Medikamente. Obwohl zahlreiche RNase H Inhibitoren (RHIs) bereits synthetisiert wurden, existieren nur wenige Studien über die Bindungsstellen dieser Inhibitoren. Deshalb war es unser Ziel, ein neues Modellsystem für Bindungsanalysen von HIV-1 RHIs, mit der RNase H aus dem Prototypischen FV (prototype foamy virus, PFV) zu etablieren. Zuerst zeigten wir, dass HIV-1 RHIs einen vergleichbaren inhibitorischen Effekt auf die PFV RNase H-Aktivität der gesamten PR-RT ausüben, was auf ähnliche Bindungstaschen in beiden Enzymen schließen lässt. In einem zweiten Schritt führten wir NMR-Titrationsexperimente des Mg2+-komplexierenden Inhibitors RDS1643 und der isolierten PFV RNase H-Domäne durch. Basierend auf unseren NMR-Ergebnissen wurde eine in silico Modellierung durchgeführt, um eine potentielle Bindungsstelle für das RD1643 in der PFV RNase H zu identifizieren. Die Bindungsregion neben dem aktiven Zentrum erlaubt Wechselwirkungen mit Mg2+ und enthält eine hydrophobe Kavität für den aromatischen Teil des Inhibitors. Aufgrund der hohen Strukturhomologie zwischen den RNase H-Domänen aus HIV-1 und PFV war es möglich eine äquivalente RDS1643-Bindungstasche in der HIV-1 RNase H zu definieren.

Level thesis:degree_level

thesis.doctoral

Grantor dc:publisher

Universität Bayreuth

Year

2015

Author dc:creator

• Schneider, Anna

Contributors dc:contributor

• Wöhrl, Birgitta M.

Repository record source_url

https://epub.uni-bayreuth.de/id/eprint/2133/

OAI identifier oai:identifier

oai:epub.uni-bayreuth.de:2133