Die Funktion des coxF-Genproduktes bei der Reifung des aktiven Zentrums der Kohlenmonoxid-Dehydrogenase in Oligotropha carboxidovorans

Die vorliegende Arbeit befasste sich mit der Rolle des CoxF-Polypeptids im Zusammenhang mit der Reifung des [CuSMoO2]-Clusters im aktiven Zentrum von Oligotropha carboxidovorans OM5. Um die Funktion(en) von CoxF bei der posttranslationalen Reifung klären zu können, wurde das Leseraster des coxF-Gens durch Insertion einer Kanamycin-Resistenzkassette inaktiviert. Der resultierende Mutantenstamm O. carboxidovorans OM5 F::km war nicht mehr in der Lage mit CO als alleinige Energie- und Kohlenstoffquelle chemolithoautotroph zu wachsen, wohingegen die Nutzung von H2 und CO2 nicht beeinträchtigt war. Dies zeigt, dass CoxF eine essentielle Funktion im CO-Stoffwechsel besitzt. Im Zuge der Anzucht mit H2 / CO2 in Gegenwart von CO als Induktor wird in O. carboxidovorans OM5 F::km eine Apo-CO-Dehydrogenase zu einem Anteil von 5,9 bis 6,9 % am Gesamtzellprotein synthetisiert. Das Enzym ist vollständig assembliert in Bezug auf seine Untereinheitenstruktur und besitzt eine funktionelle Elektronentransportkette mit stöchiometrischen Mengen an Mo-MCD, den [2Fe-2S]-Clustern vom Typ I und II, sowie dem FAD-Kofaktor. Durch Zugabe des artifiziellen Elektronendonors Dithionit konnte gezeigt werden, dass die Kofaktoren redoxaktiv sind. In der coxF-Mutante wird eine nahezu inaktive CO-Dehydrogenase gebildet (0,136 U/mg), welche 1,83 mol Mo und 1,40 mol S pro mol Protein aufweist, und Cu-defizient ist (0,045 mol Cu). Dies verdeutlicht, dass sich die Funktion von CoxF auf die posttranslationale Reifung des bimetallischen Clusters bezieht, insbesondere auf die Inkorporation von Cu. Die Biosynthese und Integration der funktionellen Kofaktoren ist von der Mutation nicht betroffen. Durch Zugabe eines Cu(I)-Thioharnstoff-Komplexes konnte die CO-oxidierende Aktivität des Enzyms der coxF-Mutante nur zu 14,2 % wiederhergestellt werden. Die vorherige Behandlung mit Sulfid in Gegenwart von Dithionit stellte 85,6 % der Aktivität wieder her. Hieraus konnte gefolgert werden, dass einerseits der cyanolysierbare Schwefel in einer inkompetenten Form vorliegt, und andererseits, dass ein hoher [MoO3]-Anteil im Präparat vorliegen muss. Mittels ESR und der teilweise erhaltenen paramagnetischen Signale konnte gezeigt werden, dass Schwefelverbindungen wie β-Mercaptoethanol, Sulfid oder L-Cystein an den Sulfido-Liganden des Mo in Cu-defizienten Zentren binden können. Auf diese Weise wurde zunächst bestätigt, dass die Sulfurierung im Zuge der chemischen Rekonstitution nicht von einem Persulfid am Cystein388 ausgeht, sondern zu einem Ligandenaustausch am Mo führt. Der Austausch einer Oxo- durch eine Sulfido-Gruppe führt zur Bildung eines [Mo(V)(=O)OH(2)SH]. Die nachfolgende Inkubation mit Schwefelverbindungen erzeugt ein [Mo(V)(=O)OH(2)SSR]-Disulfid. ESR-Spektren der CO-Dehydrogenase aus der coxF-Mutante zeigten Signale, die auf die Koexistenz verschiedener Spezies im aktiven Zentrum schließen lassen: [Mo(VI)(=O)2OH(2)] > [Mo(V)(=O)OH(2)SSH] > [Mo(VI)(=O)OH(2)SH]. Der Hauptanteil (71,4 - 79 %) stellt damit ein Trioxo-Molybdän-Zentrum dar. Der detektierte cyanolysierbare Schwefel verteilt sich auf ein persulfidisches [Mo(V)(=O)OH(2)SSH] (14,4 - 18 %) sowie ein [Mo(VI)(=O)OH(2)SH] (3 - 14,4 %). Letzteres kann mit Cu(I) zu einem aktiven Enzym rekonstituiert werden. Sequenzanalysen von CoxF haben gezeigt, dass das Polypeptid ein Motiv der XdhC / CoxI-Familie besitzt. CoxF könnte daher eine Funktion bei der Stabilisierung des Sulfido-Liganden des Mo besitzen. Dies würde den hohen [Mo(VI)(=O)2OH(2)]- sowie den niedrigen [Mo(VI)(=O)OH(2)SH]-Anteil im Präparat der coxF-Mutante erklären. Die Bildung persulfidischer Strukturen stellt dabei einen „unproduktiven“ Biosynthese-Weg dar. Translationsanalysen zeigten, dass in Extrakten der coxD-Mutante weder CoxD, noch CoxE und CoxF detektierbar sind. In der coxE- und coxF-Mutante sind die resultierenden Polypeptide stets gleichzeitig nicht vorhanden. Sequenzanalysen ergaben, dass CoxD, CoxE und CoxF Motive der DEAD-Box RNA-Helikase Familie aufweisen und damit Funktionen für ihre Translation. So erfordert die Translation von CoxE und CoxF das CoxD-Polypeptid, CoxE benötigt CoxF und umgekehrt. Diese Tatsache und experimentelle Befunde verdeutlichten, dass die CO-Dehydrogenase aus der coxF-Mutante den Phänotyp der coxE-Mutante besitzt und beide Präparate damit ununterscheidbar sind. CoxF besitzt außerdem ein Von Willebrand Faktor A - Bindemotiv, welches eine Interaktion mit der entsprechenden Bindedomäne auf CoxE ermöglicht, sowie eine für saure Histidin-Phytasen charakteristische Sequenz. Eindeutige Hinweise auf eine derartige Aktivität konnten über Saccharosedichtegradienten erhalten werden. Dass CoxF eine Funktion bei der Inkorporation des Cu-Ions erfüllt, ergibt sich auch aus einem Cu-Bindemotiv, welches dem blauer Kupferenzyme vom Typ 1 entspricht. So wird in einem Biosynthese-Modell zunächst das [Mo(VI)(=O)2OH(2)]-Zentrum reduziert und zum [Mo(V)(=O)OH(2)SH] sulfuriert. Dieser MgATP-abhängige Schritt erfordert die Funktion der membrangebundenen AAA-ATPase CoxD. Nach Reoxidation des Mo erfolgt die Cu-Insertion, welche die Polypeptide CoxE und CoxF benötigt. So könnte cytoplasmatisches CoxF Phytat-gebundenes Cu(II) durch die Hydrolyse von Phosphomonoestern freisetzen und schließlich binden. In einem Komplex aus CoxE und CoxF an der Membran wird das gebundene Cu-Ion zum Cu(I) reduziert und in das aktive Zentrum von CO-Dehydrogenase inseriert. CoxG erfüllt keine Funktion beim Reifungsprozess. So zeigte ein entsprechender Mutantenstamm CO-chemolithoautotrophes Wachstum, allerdings war die Generationszeit um mehr als das 8-fache gegenüber dem Wildtyp erhöht. In der coxG-Mutante wird eine aktive CO-Dehydrogenase gebildet, welche nahezu vollständig in Bezug auf Mo, cyanolysierbaren Schwefel und Cu ist. Dies zeigt, dass die Assemblierung des Metallclusters auf dem Niveau von CoxG abgeschlossen ist. Das Polypeptid scheint dennoch benötigt zu werden, um die cytoplasmatische CO-Dehydrogenase zur Cytoplasma-Membran zu eskortieren. An der Membran vollzieht sich die Oxidation von CO zu CO2. Die Interaktion von CoxG mit CO-Dehydrogenase und den Phosphatidylinositol-Membran-Lipiden wird über die PH-Domäne auf der Sequenz von CoxG ermöglicht. Rekombinantes CoxF wurde in E. coli AD494(DE3)/pSL1 löslich als auch in Form von Einschlusskörpern gebildet. Durch die Solubilisierung dieser Einschlusskörper und eine nachfolgende Rückfaltung konnte ein Polypeptid mit einer Reinheit von 91 % erhalten werden. Löslich exprimiertes, rekombinantes CoxF konnte mittels Gelfiltration angereichert werden. In beiden Fällen zeigte sich, dass CoxF oligomere Strukturen ausbildet. Diese Oligomerisierung konnte durch Transmissionselektronenmikroskopie bestätigt werden. So lag das rückgefaltete CoxF überwiegend in Form von 4-meren vor, während das lösliche CoxF Monomere, 6-mere, 12-mere und 18-mere ausbildete. Ähnliche oligomere Organisationen konnten für homologes CoxF auch in Extrakten von O. carboxidovorans OM5 mittels Saccharosedichtegradienten-Zentrifugation erhalten werden.

Level thesis:degree_level

thesis.doctoral

Grantor dc:publisher

Universität Bayreuth

Year

2014

Author dc:creator

• Mickoleit, Frank

Contributors dc:contributor

• Meyer, Ortwin

Repository record source_url

https://epub.uni-bayreuth.de/id/eprint/1888/

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