Prolylisomerisierung als molekulares Gedächtnis bei der Regulation von Proteinen und die Beteiligung von Prolylisomerasen an Faltungsprozessen

Das proto-onkogene Signaladapterprotein c-CrkII ist modular aus drei Domänen aufgebaut, SH2-SH3N-SH3C. NMR-Analysen zeigten, dass Pro238 in c-CrkII aus dem Huhn sowohl in cis als auch in trans Konformation vorliegen kann. Es wurde vorgeschlagen, dass diese konformationelle Heterogenität verwendet wird, um die Affinität gegenüber Liganden zu regulieren. Im Rahmen dieser Arbeit sollte untersucht werden, ob ein derartiges cis/trans Gleichgewicht auch in dem homologen Protein aus dem Mensch existiert. Durch die Analyse der Faltung und der Interaktion mit einem Peptidliganden konnte gezeigt werden, dass c-CrkII aus Mensch und Huhn unterschiedlich reguliert werden. Das humane Protein liegt permanent aktiv vor und die beiden SH3-Domänen interagieren nicht miteinander. In c-CrkII aus dem Huhn dagegen existieren zwei distinkte Zustände, die von der Konformation der Prolylbindung an Pro238 abhängen. Mit transPro238 liegt GgCrkII aktiv vor und SH3N bindet Liganden mit hoher Affinität, mit cisPro238 dagegen interagiert SH3C mit SH3N und verringert dadurch die Affinität für nachgelagerte Interaktionspartner. Allerdings stellt diese Form keinen vollständig autoinhibierten, sondern eher einen niedrig-affinen Zustand dar. In einer Substitutionsanalyse konnte dieses unterschiedliche Bindungsverhalten auf zwei Sequenzunterschiede zwischen den Proteinen der beiden Spezies zurückgeführt werden. Durch die simultane Substitution der Reste Ile239 und Val272 (im humanen Protein) durch Phe und Met (wie im Protein aus dem Huhn) konnte auch in HsCrkII ein Pro238-abhängiges Bindungsverhalten etabliert werden. Mit einer weiteren Serie von Aminosäureaustauschen in dem humanen Protein mit dem artifiziellen Prolinschalter konnten Reste identifiziert werden, die notwendig sind, damit SH3N und SH3C in Abhängigkeit der Konformation an Pro238 miteinander interagieren. Das Signal, das durch die Isomerisierung an Pro238 generiert wird, wird sowohl in den Linker hin zu SH3N als auch zu Met272 in SH3C weitergeleitet. Diese intramolekulare Signaltransduktion wird dabei durch die veränderten sterischen Ansprüche der cis und der trans Prolylbindung an Pro238 bestimmt. Zum einen wird dadurch Leu234, das cisPro238 direkt kontaktiert, im transPro238 Zustand von der jetzt anders orientierten Prolylbindung selbst verdrängt. Dies führt zu einer Auflockerung des Linkerbereichs vor Pro238. Dadurch entsteht genug Freiraum, damit Phe239 in das Innere von SH3C klappen kann und dort Druck auf Val267 ausübt. Dieses Val befindet sich am Anfang des beta-Stranges, der zu Met272 führt und der Phe239-induzierte Druck wird vermutlich entlang dieses Faltblattes zu Met272 propagiert. Dass das lösungsmittelexponierte Met272 an der Spitze einer Schleife zwischen zwei Faltblattsträngen notwendig ist, damit c-CrkII prolinabhängig reguliert wird, wurde gezeigt. Es bleibt allerdings unklar, warum diese Art der Regulation mit Val272 anstelle von Met nicht möglich ist. Durch detaillierte, kinetische Analysen konnte die Energetik der regulatorischen Prolylisomerisierung in GgCrkII aufgeklärt werden. Mit Doppelmischexperimenten war es möglich die Faltung mit der Funktion von c-CrkII zu verknüpfen. Dabei konnten die mikroskopischen Raten der Prolylisomerisierung im entfalteten Protein, im nativen Zustand, sowie im Protein-Ligand-Komplex bestimmt werden. In Kombination mit kinetischen Simulationen wurde gezeigt, dass der Faltungsprozess und schwache Domäneninteraktionen genug Energie aufbringen, um das cis/trans Gleichgewicht an Pro238 von 11/89 im entfalteten Protein zu 86/14 im nativen Protein zu verschieben. Durch die Bindung eines Liganden wird dieses Gleichgewicht zu 41/59 verschoben. Es findet dabei keine lokale Entfaltung statt, sondern die beiden SH3-Domänen liegen vielmehr entkoppelt vor, wie zwei unabhängige Proteine. Die Re-Isomerisierung an Pro238 bestimmt dabei die Lebensdauer des offenen, hoch-affinen Zustands von GgCrkII und wirkt somit als molekulares Gedächtnis der Regulation. Die zweite Möglichkeit der Regulation von c-CrkII beruht auf spezifischer Tyrosinphosphorylierung, insbesondere an Tyr222 im Linkerbereich zwischen den beiden SH3-Domänen. Durch die Analyse der Faltung und der Stabilität der in vitro phosphorylierten Proteinen, sowie der Interaktion von Liganden mit SH3N konnte gezeigt werden, dass Phosphorylierung und Prolylisomerisierung zwei unabhängige Regulationsmechanismen für c-CrkII darstellen. Die Proteine aus dem Mensch und aus dem Huhn unterscheiden sich dabei nicht. Prolylisomerisierung ist eine intrinsisch langsame Reaktion und es existieren viele Enzyme, die diese Umlagerung beschleunigen und dadurch an der Regulation von Proteinaktivitäten beteiligt sind. Im Rahmen dieser Arbeit wurde gezeigt, wie die mitochondriale Prolylisomerase mCypD durch die gerichtete Interaktion mit p53 reguliert wird. Diese Regulation ist notwendig, um die mitochondriale Permeabilitätspore zu öffnen, was schließlich zu Nekrose führt. Durch die Bindung von p53 an mCypD in der Nähe des aktiven Zentrums zeigt mCypD eine ausgeprägte Substratspezifität. p53 wirkt dabei als allosterischer Inhibitor der generellen Proteinfaltungshelferfunktion von mCypD und aktiviert das Enzym gleichzeitig für Substrate, die zur Porenöffnung notwendig sind. Am Beispiel des Triggerfaktors konnte erarbeitet werden, wie Prolylisomerasen an der Anpassung von Bakterien an extreme Lebensbedingungen beteiligt sind. Es wurde gezeigt, dass bei niedrigen Temperaturen besonders die Prolylisomeraseaktivität wichtig ist. Unter moderaten Bedingungen übt Triggerfaktor zwei Funktionen aus. Neben der hohen Aktivität als Prolylisomerase wird auch die Aggregation von Proteinen verhindert. Diese beiden Funktionen sind in Triggerfaktor aus E. coli vereint. Bei hohen Temperaturen ist Prolylisomerisierung so stark beschleunigt, dass sie keinen geschwindigkeitsbestimmenden Schritt der Proteinfaltung mehr darstellt. Daher ist die Prolylisomeraseaktivität von Triggerfaktor aus dem hyperthermophilen Organismus T. maritima nur schwach ausgeprägt, dagegen ist das Enzym aber in der Lage die Aggregation von Proteinen hocheffizient zu verhindern. Zusammenfassend konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, wie Prolylisomerisierung im nativen Zustand von Proteinen verwendet werden kann, um durch weitreichende, strukturelle Umlagerungen die Aktivität eines Proteins zu regulieren. An den Beispielen von mitochondrialem Cyclophilin und bakteriellem Triggerfaktor wurde zudem erarbeitet, wie Prolylisomerasen an derartigen, regulatorischen Prozessen beteiligt sein können und dabei sicherstellen, dass lebende Zellen schnell auf äußere Einflüsse reagieren können.

Level thesis:degree_level

thesis.doctoral

Grantor dc:publisher

Universität Bayreuth

Year

2014

Author dc:creator

• Schmidpeter, Philipp A. M.

Contributors dc:contributor

• Schmid, Franz Xaver

Repository record source_url

https://epub.uni-bayreuth.de/id/eprint/1761/

OAI identifier oai:identifier

oai:epub.uni-bayreuth.de:1761