Mia40 ist optimiert für die duale Funktion als Proteinimport- und Faltungshelfer in Mitochondrien
Die Thiol-Disulfid-Oxidase Mia40 bildet zusammen mit der Sulfhydryloxidase Erv1 ein Disulfidstaffelsystem zur oxidativen Faltung von Proteinen im mitochondrialen Intermembranraum. Substratproteine, die im Cytosol synthetisiert und anschließend durch die TOM-Pore der äußeren Mitochondrienmembran transportiert werden, werden durch Mia40 oxidiert und so durch Ausbildung des nativen Zustands an der Rückdiffusion gehindert. Der Mechanismus der Substratoxidation durch Mia40 wurde im Rahmen dieser Arbeit anhand der Interaktion mit dem natürlichen Substrat Cox17 untersucht. Wildtyp-Cox17 enthält vier Cysteine, die zwei Disulfidbrücken bilden. Zusätzlich wurden Cox17-Varianten verwendet, die nur jeweils ein, bzw. zwei Cysteine enthielten und die aufgrund gezielter Aminosäuresubstitutionen unterschiedliche Hydrophobizitäten aufwiesen. Die Kinetik der oxidativen Faltung dieser Varianten durch Mia40 wurde durch spektroskopische Messungen nach schneller Mischung und durch elektrophoretische Methoden analysiert. Weiterhin wurden die pK-Werte von Cysteinen aus Mia40 und Cox17 und die Reduktionspotentiale der gemischten Disulfide, sowie die konformationellen Stabilitäten der Proteine untersucht, um die molekularen Determinanten der Thiol-Disulfid-Austauschreaktionen zu bestimmen. Mia40 bildet zunächst über eine flache, hydrophobe Furche einen nicht kovalenten Komplex mit reduzierten Substratproteinen aus. Diese Bindung ist hoch dynamisch und nicht auf natürliche Substrate beschränkt. Die Affinität von Mia40 zu Proteinen steht in unmittelbarem Zusammenhang mit der Exposition hydrophober Bereiche und damit mit dem Faltungszustand. Aus diesem Grund interagiert Mia40 nicht mehr mit oxidiertem, nativ gefaltetem Cox17. Die vier Cysteine von Cox17 reagieren sehr unterschiedlich mit Mia40. Das hochreaktive Cys36 wird durch die drei benachbarten hydrophoben Aminosäuren Ile, Leu und Phe optimal zum aktiven Zentrum von Mia40 hin ausgerichtet und reagiert daher 400-fach schneller als Cys26 zum gemischten Disulfid. Ausgehend von diesem initialen Intermediat mit Cys36 können durch Angriff eines der drei verbliebenen Cysteine in Cox17 ein natives, oder je eines von zwei nicht nativen Disulfiden im Substrat ausgebildet werden. Die Bildung des korrekten Disulfids ist kinetisch stark begünstigt, so dass zunächst eine teiloxidierte Cox17-Spezies mit einem nativen Disulfid freigesetzt wird. Dieses Intermediat ist nach wie vor weitgehend unstrukturiert und kann so für den nachfolgenden Katalysezyklus gut mit einem weiteren Mia40-Molekül interagieren. In dieser Reaktion wird dann das zweite native Disulfid gebildet, was der geschwindigkeitsbestimmende Schritt der oxidativen Faltung von Cox17 ist. Mia40 besitzt keine Information über den korrekten Faltungsweg der Substrate. Vielmehr wird die Freisetzung des oxidierten Proteins aus dem Komplex mit Mia40 thermodynamisch durch die konformationelle Faltung des Substrats und die Einnahme des stabilen nativen Zustands angetrieben. Die eukaryotische Oxidoreduktase PDI aus dem endoplasmatischen Retikulum und die bakterielle Thioloxidase DsbA aus dem Periplasma führen Disulfidbrücken wesentlich schneller in Cox17 ein, als Mia40 dies vermag. Allerdings werden zunächst hauptsächlich falsche Disulfide gebildet. Dies kann durch die Disulfidisomerasefunktion von PDI korrigiert werden, bei Oxidation durch DsbA bleiben die nicht nativen Disulfidbrücken bestehen. Die Oxidation von Cox17 durch Mia40 führt hingegen zu korrekt verbrücktem, nativem Protein. Dies liegt in erster Linie an der extremen Langlebigkeit der gemischten Disulfide, bedingt durch günstige hydrophobe Wechselwirkungen zwischen Mia40 und Cox17. Diese Interaktionen führen zu einer Erhöhung der Konformationsstabilität von Mia40 im Komplex und damit einhergehend zu einer starken Erniedrigung des Reduktionspotentials des gemischten Disulfids gegenüber dem katalytischen Disulfid in Mia40. Die Langlebigkeit der gemischten Disulfide zwischen Mia40 und Substratproteinen ist eine wichtige Eigenschaft um dem Substrat im gebundenen Zustand ausreichend Zeit zu geben, um über mehrere Thiol-Disulfid-Austauschreaktionen ein stabiles, intramolekulares Disulfid zu bilden, das von Mia40 freigesetzt wird. Außerdem sorgt die Langlebigkeit des kovalenten Komplexes dafür, dass importierte, entfaltete Proteine zunächst im Intermembranraum gehalten werden. Fehlverbrückte Spezies konnten während der Oxidation von reduziertem Cox17 durch Mia40 mittels Gelelektrophorese nicht nachgewiesen werden. Die einfache Struktur des Substrats und die gerichtete initiale Reaktion von Mia40 mit Cys36 in Cox17, sowie die kinetische Kontrolle der Auflösung des gemischten Disulfids zugunsten der Bildung des ersten nativen Disulfids im Substrat, könnten tatsächlich zur nahezu ausschließlichen Bildung von nativem Cox17 führen. Anhand der Isomerisierung von künstlich fehlverbrücktem Cox17 in den nativen Zustand konnte aber nachgewiesen werden, dass Mia40 neben der reinen Thioloxidase- auch eine schwache, aber signifikante Disulfidisomerasefunktion besitzt. Sie könnte für die korrekte oxidative Faltung komplexer Substrate essentiell sein. Die Ergebnisse dieser Arbeit unterstreichen die mechanistischen Besonderheiten von Mia40 im Vergleich zu den gut untersuchten Enzymen der Thioredoxinfamilie. Die für Mia40 spezifische Nähe von hydrophober Bindungsfurche und katalytischem Disulfid stabilisiert das gemischte Disulfid mit Substratproteinen. Dies ist sowohl für den vektoriellen Transport der Proteine in den Intermembranraum, als auch für die Bildung nativer Disulfide im Substrat essentiell. Die simultane Optimierung von Mia40 für die schnelle Bildung langlebiger kovalenter Enzym-Substrat-Komplexe und die dennoch relativ effiziente Freisetzung oxidierter Substrate zeigt, dass Mia40 hervorragend an die duale Funktion als Importrezeptor und zentrale Thioloxidase des mitochondrialen Intermembranraums angepasst ist.
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