Rekombinante Herstellung und Charakterisierung flankierender Domänen der M. galloprovincialis preCol-Moleküle.

Muscheln der Gattung Mytilus haben zur Besiedelung von Gezeitenzonen ein als Byssus bezeichnetes Verankerungssytem entwickelt, welches unter den dort vorherrschenden Bedingungen ein stabiles Anhaften am Untergrund und Schutz vor durch Wellen und Strömungen verursachten Kräften gewährleistet. Der strukturelle Kern eines jeden Byssusfadens, der für die Aufnahme und Dissipation mechanischer Kräfte hauptverantwortlich ist, wird von drei unterscheidbaren, als preCols bezeichneten Proteinen gebildet. Diese zeigen auf molekularer Ebene eine modulare Domänenstruktur. Die ungefähr die Hälfte des Proteins dominierende Kollagendomäne, an die carboxylterminal ein Cluster saurer Aminosäuren anschließt, sowie Termini, die durch einen hohen Anteil von Histidin sowie 3,4-Dihydroxyphenylalanin (DOPA) gekennzeichnet sind, sind allen drei preCols gemein. Unterschiede zeigen sich hauptsächlich in den die Kollagendomäne und den Cluster saurer Aminosäuren flankierenden Regionen, da diese entweder aus elastinähnlichen, aus seidenähnlichen oder aus glycinreichen Konsensusmotiven bestehen. Die Unterschiede zwischen den flankierenden Regionen sowie das spezifisches Verteilungsmuster der preCols entlang der Fadenachse spiegeln sich direkt in den entlang der Fadenachse variierenden mechanischen Eigenschaften der Byssusfäden wieder. Deshalb wird den flankierenden Regionen auch in erster Linie eine Rolle bei der Festlegung dieser mechanischen Eigenschaften zugeschrieben. Ziel der hier vorliegenden Arbeit war es, die flankierenden Regionen der M. galloprovincialis preCols rekombinant als eigenständige Proteine in E. coli herzustellen, um durch deren biochemische und -physikalische Untersuchungen die Sequenz-Struktur-Funktions-Beziehungen detaillierter aufzuklären und dadurch weitere Informationen über Rolle und Funktion der flankierenden Domänen in vivo zu erhalten. Zunächst konnte eine Expressions- und Reinigungsstrategie entwickelt werden, die es ausgehend von einer cDNA-Datenbank des Muschelfußgewebes von M. galloprovincialis erlaubt, auf der Aminosäuresequenz der flankierenden Regionen beruhende flank-Proteine rekombinant herzustellen. Durch die Verwendung sowohl nativer wie auch an die Codonverwendung des prokaryotischen Wirtsorganismus angepasster Nukleotidsequenzen konnte gezeigt werden, dass das Auftreten von verkürzten Versionen der Zielproteine während der Proteinbiosynthese in erster Linie auf in vivo Abbauprozesse und weniger auf eine schlechte Translationseffizienz zurückzuführen war. Durch simultane Verwendung zweier großer, gefalteter tags konnte durch Abschirmung der eigentlichen flank-Sequenz deren in vivo-Abbau minimiert und über sequentielle tag-Abspaltungen und säulenchromatographische Reinigungsschritte schließlich rekombinantes flank-Protein hergestellt werden. Ein der carboxyterminal flankierenden Region von preCol-NG entsprechendes Protein (cwCT(F34W)) zeigte in verschiedenen wässrigen Lösungen eine intrinsisch entfaltete Struktur mit Hinweisen auf untergeordnete 31-helikalen Strukturanteile und war zeitlich wie auch thermisch stabil in Lösung. In Gegenwart bestimmter SUV kam es jedoch zur Induktion von Sekundärstruktur und einem Übergang der intrinsisch entfalteten hin zu einer β-faltblattdominierten Konformation. Die Art der Strukturinduktion ähnelt dem partitioning-folding coupling (PFC) bei der Faltung von Membranproteinen. Mit Hilfe einer whole-residue Hydrophobizitätsanalyse gelang die Identifizierung eines Aminosäurebereichs innerhalb von cwCT(F34W), der mit der SUV-Lipiddoppelmembran interagieren kann und der durch PFC-ähnliche Prozesse zudem zur Ausbildung einer β-Haarnadelkonformation neigt. Zudem sprechen die experimentellen und bioinformatischen Daten dafür, dass es zu einer Integration der β-Haarnadel in die SUV-Lipiddoppelmembran kommt. Die anhand von cwCT(F34W) gewonnenen Erkenntnisse legen nicht nur nahe, dass die carboxyterminal flankierende Region von preCol-NG auch während der Proteinassemblierung und Entstehung der Byssusfäden sowie deren Selbstheilung eine wichtige Rolle spielen kann, sondern eröffnet auch Möglichkeiten für die (Weiter-)Entwicklung selbst-heilender Biomaterialien.

Level thesis:degree_level

thesis.doctoral

Grantor dc:publisher

Universität Bayreuth

Year

2014

Author dc:creator

• Heim, Markus

Contributors dc:contributor

• Scheibel, Thomas

Repository record source_url

https://epub.uni-bayreuth.de/id/eprint/1722/

OAI identifier oai:identifier

oai:epub.uni-bayreuth.de:1722