Charakterisierung modularer Peptidyl-Prolyl-cis-trans-Isomerasen

Im Rahmen dieser Arbeit sollte ein tieferer Einblick in die Funktionsweise modular aufgebauter Peptidyl-Prolyl-cis-trans-Isomerasen gewonnen werden. Diese bestehen aus mehreren Domänen: Eine enzymatisch aktive Prolylisomerasedomäne wird durch eine oder mehrere zusätzliche Domänen in ihrer Wirkung unterstützt. Das Hauptaugenmerk dieser Arbeit lag auf dem Trigger-Faktor aus E.coli. Trigger-Faktor ist ein ribosomenassoziierter Faltungshelfer, der auf einer Proteinkette zwei Funktionen vereint: Chaperonaktivität und Prolylisomeraseaktivität gegenüber naszierenden Proteinketten. Im Rahmen dieser Arbeit konnte ich zeigen, dass diese Chaperonaktivität stark genug ist, das Ausfallen eines aggregationsanfälligen Proteins völlig zu unterdrücken. Auf den ersten Blick erscheint die Chaperonbindung einer naszierenden Proteinkette unmittelbar am Ribosom ideal. Jedoch kann diese unspezifische Bindung auch schnelle Faltungsreaktionen behindern. In dieser Arbeit konnte ich nachweisen, dass Trigger-Faktor tatsächlich die in vitro-Faltung sowohl eines Proteins mit „nativen“ Prolylisomeren als auch eines Proteins, das bei seiner Faltung gar keine Prolylisomerisierungen durchläuft, verlangsamt. Bei derartigen Rückfaltungsexperimenten treten die Chaperon- und PPIaseaktivitäten in unterschiedlichen Konzentrationsbereichen zutage: Bei nanomolaren Konzentrationen dominiert die Prolylisomerasefunktion, während im mikromolaren Bereich die Bindungsfunktion und somit der Chaperoncharakter überwiegt. Die Bindung des Trigger-Faktors an zwei verschiedene entfaltete Proteine, von denen bekannt war, dass sie als kompetitive Inhibitoren wirken, wurde kinetisch untersucht. Dabei zeigte sich, dass die oben beschriebenen, für die Faltung ungünstigen Effekte durch eine schnelle Substratbindung und –freisetzung minimiert werden. Der Komplex zwischen Trigger-Faktor und Substrat ist mit einer Halbwertszeit von nur ca. 120 ms sehr kurzlebig. Die Komplexassoziation verläuft im selben Zeitfenster. Daher können sich schnell faltende Proteine einer unerwünschten Bindung entziehen, während Proteine mit nicht-nativen Prolylisomeren nicht fertig falten und somit erneut zur Katalyse an Trigger-Faktor binden können. Anders als DnaK bindet Trigger-Faktor seine Substrate dynamisch und nukleotidunabhängig. Dies dürfte für eine hohe katalytische Aktivität von Vorteil sein, nicht jedoch für eine möglichst effiziente Chaperonwirkung. Die synthetische Letalität, die auftritt, wenn die Gene für DnaK und Trigger-Faktor gleichzeitig ausgeschaltet werden, dürfte daher eher von einer indirekten Kopplung als von überlappenden Funktionen herrühren. In Abwesenheit von Trigger-Faktor ist die Proteinfaltung verzögert und somit entstehen mehr Proteinaggregate. Fehlt gleichzeitig DnaK, kann diese Aggregatbildung nicht mehr unterdrückt werden und auch die Entsorgung dieser Aggregate findet nicht mehr ausreichend statt. Abgesehen von den Unterschieden bei der Wirkungsweise von Trigger-Faktor und DnaK konnte ich in dieser Arbeit zeigen, dass beide ähnliche Bindungsmotive besitzen: Das typische TF-Bindungsmotiv ist eine Sequenz aus ca. acht Aminosäuren mit bevorzugt basischen und hydrophoben Resten. Es ist vorstellbar, dass sich solch eine Häufung hydrophober und positiv geladener Aminosäuren als generelles Erkennungsmotiv verschiedener Chaperone für entfaltete Proteine entwickelt hat. Zusätzlich zur Bindungsdynamik zwischen Trigger-Faktor und Proteinsubstraten war die Kinetik der Assoziation mit dem Ribosom für diese Arbeit von besonderem Interesse. Ich habe Trigger-Faktor in seiner ribosomenbindenden N-terminalen Domäne mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert und untersucht, wie TF mit dem Ribosom wechselwirkt. Durch Fluoreszenzmessungen konnte ich zeigen, dass Assoziation und Dissoziation des TF-Ribosomenkomplexes verhältnismäßig langsame Prozesse sind. Die durchschnittliche Lebenszeit des Komplexes liegt bei 20°C bei 30 s. Es besteht also ein großer Unterschied in der Dynamik der Wechselwirkungen des Trigger-Faktors mit Ribosomen und mit Proteinsubstraten. Dadurch wird sichergestellt, dass Trigger-Faktor während der gesamten Synthesezeit einer Proteindomäne am Ribosom gebunden bleibt, während er die neu entstehende Kette durch schnelles Binden und Loslassen nach zu isomerisierenden Prolylbindungen absuchen kann. Sechs weitere modular aufgebaute PPIasen wurden im Rahmen dieser Arbeit untersucht. Für einige von ihnen konnte gezeigt werden, dass sie ideale technische Hilfsmittel für die rekombinante Expression aggregationsempfindlicher Proteine sind. Durch kovalente Fusion an ein instabiles leicht aggregierendes Protein konnte dies für lange Zeit in Lösung gehalten werden. Interessanterweise spielte die Prolylisomeraseaktivität für diese Anwendung keine Rolle. Ich konnte zeigen, dass SlyD, FkpA und SurA aus E. coli, FKBP18 aus Thermococcus sp. KS-1 und TF aus Thermotoga maritima gegenüber faltenden Proteinsubtraten eine deutlich höhere Prolylisomeraseaktivität zeigen als eine isolierte FKBP-Domäne. Nur FKBP22 aus Neurospora crassa besitzt eine sehr schwache Aktivität, die durch die zusätzliche Domäne in keiner Weise unterstützt wird. Bei den beiden PPIasen aus thermophilen Organismen, TcFKBP18 und TmTF, zeigte sich die größere Aktivität erst bei höheren Temperaturen. Es ist bemerkenswert, dass sogar Organismen, die bei 80°C und mehr leben, Prolylisomerasen nutzen, obwohl doch die spontane Isomerisierungsgeschwindigkeit bei diesen Temperaturen hoch genug sein sollte, um eine effiziente Proteinfaltung zu ermöglichen. All diese hochaktiven Prolylisomerasen verdanken ihre verbesserte Aktivität der Mitwirkung mindestens einer zusätzlichen Domäne. Diese zusätzliche Domäne bietet eine weitere, wenig spezifische Substratbindungsstelle für entfaltete Proteine. Daher zeigen alle dieser stark aktiven modularen Prolylisomerasen auch Chaperonaktivität. Durch Bindung entfalteter Proteine erhöhen die Chaperondomänen in der Umgebung des aktiven Zentrums der Prolylisomerase die Konzentration potentieller Substrate und machen die Isomerase so zu einem hocheffizienten Faltungshelferenzym.

Level thesis:degree_level

thesis.doctoral

Grantor dc:publisher

Universität Bayreuth

Year

2014

Author dc:creator

• Maier, Raimund

Contributors dc:contributor

• Schmid, Franz Xaver

Repository record source_url

https://epub.uni-bayreuth.de/id/eprint/1708/

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