Foamy Virus RNase H - Aktivität, Struktur und Funktion

Zusammenfassung Das für die Replikation des RNA-Genoms von Foamy Viren (FV) notwendige Enzym, die Protease-Reverse Transkriptase (PR-RT), beinhaltet die Protease-, die Polymerase- und RNase H-Domäne. Letztere ist für den Abbau der RNA im entstehenden RNA/DNA Hybrid verantwortlich. Während die FV PR-RT als Monomer vorliegt, besteht die HIV-1 RT aus einem p66/p51-Heterodimer. Erstaunlicherweise ist die isolierte HIV-1 RNase H im Vergleich zur z.B. E. coli oder separaten MoMLV RNase H nicht aktiv. Aus den Sequenzvergleichen verschiedener RNase H-Domänen ergibt sich, dass die Prototyp FV (PFV) RNase H im Gegensatz zur HIV-1 RNase H einen Sekundärstrukturbereich aufweist, bei dem es sich um die sogenannte C-Helix mit einer sich anschließenden basischen Schleife (basic protrusion) handelt. Da zu Beginn der Arbeit keine 3D-Struktur einer retroviralen RNase H mit basic protrusion bekannt war, sollte in dieser Arbeit die Struktur der PFV RNase H und die Funktion der basic protrusion bei der Substratbindung geklärt werden. Die Tertiärstruktur der PFV RNase H-Domäne konnte mit NMR-Spektroskopie gelöst werden. Somit war es möglich, die basic protrusion einschließlich der C-Helix zu identifizieren. Die isolierte RNase H-Domäne zeigte in fluoreszenzbasierten Tests sowie in qualitativen RNase H-Versuchen mit radioaktiv markiertem Substrat Aktivität. Um die Funktion der C-Helix und der sich anschließenden basischen Schleife bei der Substratbindung zu analysieren, wurden NMR-Titrationsexperimente durchgeführt. Dafür wurde die PFV RNase H-Domäne zunächst durch den Austausch der zwei katalytisch wichtigen Reste Aspartat 599 und Histidin 724 zu Asparagin inaktiviert (RNase H-(D599N-H724N)), um den Abbau des Substrates während der Messungen zu vermeiden. Die Auswertung von [15N, 1H]-HSQC- und [1H, 15N, 1H]-NOESY-HSQC-Spektren erbrachte eine Übereinstimmung der Tertiärstrukturen der RNase H-(D599N-H724N) mit der wt RNase H. Die NMR-Titrationsexperimente zeigten, dass die C-Helix in der PFV RNase H wie ein Lineal agiert, das die sich anschließende basische Schleife zum Substrat orientiert. Darüber hinaus besitzt die basic protrusion zusätzlich eine Reihe an positiv geladenen Resten, die gut lösungsmittelzugänglich sind und dadurch erste Kontakte mit dem Substrat ermöglichen. Damit bietet die basic protrusion eine Art Plattform für die Substratbindung. Der HIV-1 RNase H fehlt nicht nur die C-Helix, zusätzlich ist die sich anschließende Schleife vermutlich zu kurz, um das Substrat zu binden. Da diese Schleife außerdem nur über einen basischen Rest verfügt, ist wahrscheinlich auch die Gesamtaffinität dieses Bereichs für die Substratbindung zu gering. Strukturvergleiche der PFV RNase H mit der HIV-1 RT zeigen, dass die fehlende basic protrusion der HIV-1 RNase H durch eine Schleife aus der Verbindungs-Subdomäne der p66-Untereinheit kompensiert wird. Dieser Bereich könnte somit ein neuer Angriffspunkt für Inhibitoren in der antiretroviralen Therapie bei HIV 1 sein. Um zukünftig weitere Strukturanalysen mit der PR-RT bzw. mit einzelnen Domänen durchführen zu können, wurden in einem weiteren Projekt verschiedene N- und C-terminale Deletionsvarianten der PR-RT des Simian Foamy Virus hergestellt. Durch Aktivitätstests mit diesen Deletionsvarianten konnten die Abgrenzungen für die PR-, die Polymerase-, die RNase H-Domäne und die Verbindungs-Subdomäne in der PR-RT identifiziert werden. Dabei zeigte sich, dass die Region H107-N143 C-terminal von der PR wichtig für die Funktion der Polymerase ist. Die Deletion der RNase H-Domäne und Verbindungs-Subdomäne führte zu einer drastischen Abnahme der Substrataffinität, Integrität und Polymerisationsfähigkeit des Enzyms. Trotzdem konnte eine minimale Polymerase-Domäne bestimmt werden (RT(107 454)), die ohne PR- und RNase H-Domäne sowie ohne die Verbindungs-Subdomäne in der Lage ist, zu polymerisieren. Für die Dimerisierung und damit Aktivierung der PR, die durch Bindung von zwei PR-RTs an das sog. PARM-Element (engl. protease activating RNA motif) auf der genomischen RNA geschieht, sind jedoch die RNase H-Domäne und die Verbindungs-Subdomäne unverzichtbar. Dadurch ist die RNase H nicht nur für die reverse Transkription essenziell; in FV stellt sie auch ein Regulationselement für die PR-Aktivierung dar und ist somit indirekt an der Prozessierung von Gag (Strukturproteine) und Pol (virale Enzyme) beteiligt.

Level thesis:degree_level

thesis.doctoral

Grantor dc:publisher

Universität Bayreuth

Year

2013

Author dc:creator

• Leo, Berit

Contributors dc:contributor

• Wöhrl, Birgitta

Repository record source_url

https://epub.uni-bayreuth.de/id/eprint/121/

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