Untersuchungen zur stimulierten GTPase von EF-Tu aus Thermus thermophilus
In dieser Arbeit konnten die Unterschiede im Mechanismus der GTP-Hydrolyse und der Hydrolyse von GTP-Analoga identifiziert werden: i) Ein gamma-Phosphoamid Derivat des GTP (MAAP-GTP) wird dabei gar nicht, ein anderes Derivat (DABP-GTP), das zusätzlich eine vicinal zum gamma-Phosphat stehende Aminogruppe trägt, 780-fach schneller als GTP durch EF-Tu hydrolysiert. ii) Die geschwindigkeitsbestimmenden Schritte der DABP-GTPase und der GTPase unterscheiden sich. Bei der GTPase ist der nuklophile Angriff, bei der DABP-GTPase ein Protontransfer, vermutlich die Protonierung des gamma-Phosphates, der langsamste Schritt der Reaktion. iii) Bei der DABP-GTPase spielt, im Gegensatz zur GTPase, keine der getesteten Aminosäuren aus dem aktiven Zentrum des EF-Tu eine wichtige Rolle bei der Hydrolyse. iv) DABP-GTPase verläuft durch eine intramolekulare Aminolyse und nicht durch einen nukleophilen Angriff eines Wassermoleküls. Diese aktive Beteiligung des DABP-GTP an seiner Spaltung stellt eine neue Art der Substrat-assistierten Katalyse dar. v) Die Analoga induzieren die GTP-gebundene Form des EF-Tu und ermöglichen die Bindung der aa-tRNA. Das bedeutet, dass eine hydrophobe Modifikation am gamma-Phosphat des GTP zu keiner bedeutenden strukturellen Änderung der Regionen des EF-Tu, die wichtig für die Interaktion mit seinen Effektoren sind, führt. Weiter wurden Cystein-Mutanten von EF-Tu, C82A/L404C und C82A/P357C, hergestellt und mit einem Coumarin-Derivat modifiziert. Eine tRNAPhe aus E. coli wurde an der acp3U47-Base mit einem Fluoreszein-Derivat modifiziert und gereinigt. Bei den, auf FRET-basierenden, Fluoreszenztitrationsexperimenten konnten die Affinitäten der fluoreszierenden EF-Tu Varianten zur Phe-tRNAPhe-X47F wegen einem starken Fluoreszenzhintergrund und dementsprechend schwachen Signal nur ungenau bestimmt werden. Das FRET-Assay konnte wegen dem kleinen Signal und seiner nicht eindeutigen Interpretation bei der Interaktion des fluoreszenzmarkierten ternären Komplexes mit dem Ribosom nicht zur kinetischen Untersuchungen der stimulierten GTPase von EF-Tu eingesetzt werden. Obwohl das FRET-Signal klein war, konnte die durch den Nukleotidaustausch bedingte Dissoziation des ternären Komplex kinetisch verfolgt werden. Es wurden zusätzlich Experimente zur Argininfinger Hypothese durchgeführt. Um die Funktion des konservierten Arginins 80 im ribosomalen Protein L12 aus T. thermophilus zu untersuchen wurde eine L12-R80A Mutante gereinigt. Das Wildtyp L12 wurde in den Ribosomen durch die R80A Mutante ersetzt. Die Fähigkeit dieser Ribosomen die intrinsische GTPase von EF-Tu zu stimulieren wurde mittels Hydrolyse von [gamma-32P]GTP geprüft. Für die Untersuchungen der Aktivierung der stimulierten GTPase wurde ein auf mant-dGTP Fluoreszenz basiertes Assay im T. thermophilus System etabliert. Die gegenüber den Wildtyp Ribosomen kleinen Unterschiede in der Rate der GTP-Hydrolyse und GTPase-Aktivierung deuten eher auf eine Rolle des L12-Arg80 bei der Bindung des ternären Komplexes an das Ribosom als bei der Katalyse der GTPase hin. Ähnlich wurde auch die Funktion der Arginine 57 und 59 aus der Effektorregion des EF-Tu untersucht. Hier wurden ebenfalls für einen Argininfinger relativ zum Wildtyp EF-Tu zu kleine Differenzen in der GTP-Hydrolyse und GTPase-Aktivierung beobachtet.
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