In vitro-Selektion am lentiviralen Transaktivator-Protein aus HIV-1

In der vorliegenden Arbeit konnte für das lentivirale Transaktivatorprotein HIV-1-Tat ein ternäres Phagen-Display-System etabliert werden. Die Bindung von phagenpräsentiertem HIV-Tat an HIV-TAR-RNA erfolgt im Phagen-Display nur mit geringer Affinität. Durch die Erweiterung des Tat-TAR-Phagen-Displays mit dem zellulären Kofaktor Cyclin T1 konnte die Affinität und Spezifität der Bindung von HIV-Tat an HIV-TAR-RNA gesteigert werden. Somit konnte zum ersten Mal der in vitro und in vivo dokumentierte Einfluss eines Kofaktors in einem Phagen-Display-System reproduziert werden. Bereits durch erste funktionelle Tests des ternären Phagen-Display-Systems konnte gezeigt werden, dass der Verlust der basischen Aminosäuren der basischen Sequenzdomäne von HIV-Tat keine negative Auswirkung auf die Wechselwirkung zwischen Cyclin T1 und HIV-Tat hat. Für die weitere Untersuchung der Rolle der Aminosäuren der basischen Sequenzdomäne wurden voneinander unabhängige Tat-random-Bibliotheken konstruiert, in denen die Aminosäurepositionen R49, K50, K51, R52 bzw. die Aminosäurepositionen R53, R55, R56, R57 vollständig randomisiert wurden. Zusätzlich wurde eine Tat-C31S-random-Bibliothek basierend auf der Mutante Tat-C31S konstruiert, in der die Randomisierung an den Positionen R53, R55, R56, R57 erfolgte. Die Bibliotheken erwiesen sich mit einer Anzahl an unabhängigen Klonen zwischen 1,1 x 106 und 1,5 x106 als ausreichend divers für eine Selektion. Das Selektionssystem ermöglicht die Anreicherung von Tat-Varianten, die tatsächlich unter den gegebenen Selektionsbedingungen d.h. in Anwesenheit oder Abwesenheit von Cyclin T1 an TAR-RNA binden. Tat-wt wurde in keiner der Selektionen angereichert. Ebenso wurde keine Präferenz für basische Aminosäuren erhalten. Sie scheinen für die Bindung von HIV-Tat an TAR-RNA nicht notwendig zu sein. Alle selektierten Tat-Varianten besitzen die Fähigkeit, einen ternären Tat-TAR-Cyclin T1-Komplex auszubilden. Alle charakterisierten Tat-Varianten besitzen in vivo Transaktivierungsaktivität, die mit der Lokalisation der Tat-Variante in der Zelle korreliert ist. Tat-Varianten, die ausschließlich im Kern lokalisieren, weisen die größte Aktivität auf, während Tat-Varianten, die nur in geringem Maß in die Zelle gelangen auch nur eine geringe Aktivität aufweisen. Die Anhäufung von Argininen und Lysinen innerhalb eines Peptides übt keinen entgegengesetzten Selektionsdruck aus. Dies konnte durch die Selektion einer Ph.D.12-Peptidbibliothek nachgewiesen werden. Unter verschiedenen Selktionsbedingungen konnten Peptide selektiert werden, die mit verschiedenen Affinitäten und Spezifitäten TAR-RNA binden. Unter unspezifischen Bedingungen konnte ein Peptid mit einer großen Anzahl an basischen Aminosäuren gefunden werden, welches hochaffin aber unspezifisch an TAR-RNA bindet. Im Gegensatz dazu wurden unter spezifischen Bedingungen Peptide gefunden, die mit hoher Affinität spezifisch an TAR-RNA binden. In dieser Arbeit wurde zum ersten Mal ein ternäres Phagen-Display-System für die Untersuchung von Protein-RNA Wechselwirkungen genutzt. Damit gelang es, Aufschluss über die Bedeutung der basischen Sequenzdomäne von HIV-1-Tat für die Bindung an TAR RNA zu erhalten.

Level thesis:degree_level

thesis.doctoral

Grantor dc:publisher

Universität Bayreuth

Year

2002

Author dc:creator

• Jonas, Gesa

Contributors dc:contributor

• Willbold, Dieter

Repository record source_url

https://epub.uni-bayreuth.de/id/eprint/1015/

OAI identifier oai:identifier

oai:epub.uni-bayreuth.de:1015