{"id":{"repo_id":"athens","oai_identifier":"oai:lib.uoa.gr:uoadl:5376222"},"canonical_url":"https://search.dev.ndltd.org/etd/athens/oai:lib.uoa.gr:uoadl:5376222","repository":{"repo_id":"athens","name":"National and Kapodistrian University of Athens","base_url":"https://pergamos.lib.uoa.gr/uoa/dl/frontend/oaipmh"},"display":{"title":"De novo Design of Mini-Protein Binders Targeting Allosteric Sites of MALT1 Towards Cancer Therapeutics","abstract":"Η MALT1 (Mucosa-Associated Lymphoid Tissue Lymphoma Translocation Protein 1) αποτελεί βασικό ρυθμιστή της σηματοδότησης NF-κB, και η απορρύθμιση της δραστηριότητάς της εμπλέκεται σε ποικίλες αιματολογικές κακοήθειες και συμπαγείς όγκους, συμπεριλαμβανομένων του γλοιοβλαστώματος και του παγκρεατικού αδενοκαρκινώματος. Ο διττός ρόλος της στην επιβίωση των καρκινικών κυττάρων και στη διατήρηση των ανοσοκατασταλτικών ρυθμιστικών Τ κυττάρων (Τregs) στο μικροπεριβάλλον του όγκου καθιστά τη μερική αλλοστερική αναστολή την προτιμώμενη θεραπευτική στρατηγική - επαρκής για να παρεμποδίσει την ογκογόνο σηματοδότηση και τον επαναπρογραμματισμό των διηθούντων τον όγκο Tregs, ενώ παράλληλα διατηρεί επαρκή δραστηριότητα ώστε να αποφεύγεται συστηματική αυτοανοσία. Παρά την κλινική πρόοδο πολλαπλών μικρομοριακών αναστολέων, μακρομοριακές θεραπευτικές προσεγγίσεις και πρωτεϊνικοί προσδέτες έναντι της MALT1 δεν έχουν ακόμη αναφερθεί. Στην παρούσα μελέτη αναπτύξαμε μια in silico εκστρατεία σχεδιασμού de novo μικρών πρωτεϊνικών προσδετών στοχεύοντας δύο δομικά και λειτουργικά διακριτές αλλοστερικές θέσεις στην ανθρώπινη MALT1: τη Θέση 1 στην επιφάνεια της δομικής επικράτειας παρακασπάσης (PDB: 3V55, apo διαμόρφωση, hotspots V395, L440, I445, L448) και τη Θέση 2 στη διεπαφή των περιοχών παρακασπάσης/Ig3 (PDB: 6H4A, holo διαμόρφωση, hotspots V381, L383, N393, L401), με στόχο τον εντοπισμό ενός ποικιλόμορφου συνόλου υποψηφίων μορίων υψηλής υπολογιστικής αξιοπιστίας, κατάλληλων για πειραματική αξιολόγηση. Υλοποιήθηκε μια ολοκληρωμένη υπολογιστική μεθοδολογία που περιλάμβανε: de novo δημιουργία πρωτεϊνικών σκελετών με RFdiffusion (100.000 ανά θέση), σχεδιασμό αμινοξικής αλληλουχίας με SolubleMPNN, δομικό έλεγχο με AlphaFold3 όλων των συμπλόκων προσδέτη-MALT1, σειριακό φιλτράρισμα δύο σταδίων με κριτήρια δομικής αξιοπιστίας και δυνατότητας ανάπτυξης στο εργαστήριο, ανάλυση αμινοξικής ακολουθίας και δομικής ποικιλομορφίας με ιεραρχική ομαδοποίηση Ward και λεπτομερή χαρακτηρισμό των διεπαφών δέσμευσης δέκα επιλεγμένων υποψηφίων σε τρία επίπεδα εμπιστοσύνης χρησιμοποιώντας το AlphaBridge. Μέσω σταδιακού φιλτραρίσματος, από περίπου 200.000 αρχικούς προσδέτες (100.000 ανά θέση), διακρίναμε 505 (0.51%) πρωτεϊνικά μόρια για τη Θέση 1 και 961 (0.96%) για τη Θέση 2 που εμφανίζουν υψηλή προβλεπόμενη ποιότητα δέσμευσης, αυξημένη διαλυτότητα και ποικιλομορφία. Η ιεραρχική ομαδοποίηση Ward κατένειμε κάθε σύνολο σε πέντε δομικές ομάδες, παράγοντας δέκα αντιπροσωπευτικούς κορυφαίους προσδέτες – πέντε για κάθε θέση. Η παρούσα εργασία παρουσιάζει την πρώτη απόπειρα de novo σχεδιασμού μικρών πρωτεϊνικών συνδετών έναντι της παρακασπάσης MALT1, παρέχοντας δέκα δομικά χαρακτηρισμένους υποψηφίους υψηλής υπολογιστικής αξιοπιστίας σε δύο αλλοστερικές θέσεις, μέσω μιας αρθρωτής ολοκληρωμένης μεθοδολογίας τεχνητής νοημοσύνης που μπορεί δυνητικά να εφαρμοστεί σε ποικίλους πρωτεϊνικούς στόχους. Οι επιλεγμένοι υποψήφιοι θα αξιολογηθούν σε καρκινικές κυτταρικές σειρές υπερεκφράζουσες MALT1, προερχόμενες από ασθενείς με αδενοκαρκίνωμα παγκρέατος ή γλοιοβλάστωμα.","abstract_html":"Η MALT1 (Mucosa-Associated Lymphoid Tissue Lymphoma Translocation Protein 1) αποτελεί βασικό ρυθμιστή της σηματοδότησης NF-κB, και η απορρύθμιση της δραστηριότητάς της εμπλέκεται σε ποικίλες αιματολογικές κακοήθειες και συμπαγείς όγκους, συμπεριλαμβανομένων του γλοιοβλαστώματος και του παγκρεατικού αδενοκαρκινώματος. Ο διττός ρόλος της στην επιβίωση των καρκινικών κυττάρων και στη διατήρηση των ανοσοκατασταλτικών ρυθμιστικών Τ κυττάρων (Τregs) στο μικροπεριβάλλον του όγκου καθιστά τη μερική αλλοστερική αναστολή την προτιμώμενη θεραπευτική στρατηγική - επαρκής για να παρεμποδίσει την ογκογόνο σηματοδότηση και τον επαναπρογραμματισμό των διηθούντων τον όγκο Tregs, ενώ παράλληλα διατηρεί επαρκή δραστηριότητα ώστε να αποφεύγεται συστηματική αυτοανοσία. Παρά την κλινική πρόοδο πολλαπλών μικρομοριακών αναστολέων, μακρομοριακές θεραπευτικές προσεγγίσεις και πρωτεϊνικοί προσδέτες έναντι της MALT1 δεν έχουν ακόμη αναφερθεί. Στην παρούσα μελέτη αναπτύξαμε μια in silico εκστρατεία σχεδιασμού de novo μικρών πρωτεϊνικών προσδετών στοχεύοντας δύο δομικά και λειτουργικά διακριτές αλλοστερικές θέσεις στην ανθρώπινη MALT1: τη Θέση 1 στην επιφάνεια της δομικής επικράτειας παρακασπάσης (PDB: 3V55, apo διαμόρφωση, hotspots V395, L440, I445, L448) και τη Θέση 2 στη διεπαφή των περιοχών παρακασπάσης/Ig3 (PDB: 6H4A, holo διαμόρφωση, hotspots V381, L383, N393, L401), με στόχο τον εντοπισμό ενός ποικιλόμορφου συνόλου υποψηφίων μορίων υψηλής υπολογιστικής αξιοπιστίας, κατάλληλων για πειραματική αξιολόγηση. Υλοποιήθηκε μια ολοκληρωμένη υπολογιστική μεθοδολογία που περιλάμβανε: de novo δημιουργία πρωτεϊνικών σκελετών με RFdiffusion (100.000 ανά θέση), σχεδιασμό αμινοξικής αλληλουχίας με SolubleMPNN, δομικό έλεγχο με AlphaFold3 όλων των συμπλόκων προσδέτη-MALT1, σειριακό φιλτράρισμα δύο σταδίων με κριτήρια δομικής αξιοπιστίας και δυνατότητας ανάπτυξης στο εργαστήριο, ανάλυση αμινοξικής ακολουθίας και δομικής ποικιλομορφίας με ιεραρχική ομαδοποίηση Ward και λεπτομερή χαρακτηρισμό των διεπαφών δέσμευσης δέκα επιλεγμένων υποψηφίων σε τρία επίπεδα εμπιστοσύνης χρησιμοποιώντας το AlphaBridge. Μέσω σταδιακού φιλτραρίσματος, από περίπου 200.000 αρχικούς προσδέτες (100.000 ανά θέση), διακρίναμε 505 (0.51%) πρωτεϊνικά μόρια για τη Θέση 1 και 961 (0.96%) για τη Θέση 2 που εμφανίζουν υψηλή προβλεπόμενη ποιότητα δέσμευσης, αυξημένη διαλυτότητα και ποικιλομορφία. Η ιεραρχική ομαδοποίηση Ward κατένειμε κάθε σύνολο σε πέντε δομικές ομάδες, παράγοντας δέκα αντιπροσωπευτικούς κορυφαίους προσδέτες – πέντε για κάθε θέση. Η παρούσα εργασία παρουσιάζει την πρώτη απόπειρα de novo σχεδιασμού μικρών πρωτεϊνικών συνδετών έναντι της παρακασπάσης MALT1, παρέχοντας δέκα δομικά χαρακτηρισμένους υποψηφίους υψηλής υπολογιστικής αξιοπιστίας σε δύο αλλοστερικές θέσεις, μέσω μιας αρθρωτής ολοκληρωμένης μεθοδολογίας τεχνητής νοημοσύνης που μπορεί δυνητικά να εφαρμοστεί σε ποικίλους πρωτεϊνικούς στόχους. Οι επιλεγμένοι υποψήφιοι θα αξιολογηθούν σε καρκινικές κυτταρικές σειρές υπερεκφράζουσες MALT1, προερχόμενες από ασθενείς με αδενοκαρκίνωμα παγκρέατος ή γλοιοβλάστωμα.","abstract_has_math":false,"creators":["Τσιούνη Ειρήνη","Tsiouni Eirini"],"institution":null,"degree_name":null,"degree_level":null,"degree_discipline":null,"degree_department":null,"school":null,"contributors":[],"advisors":[],"committee_chairs":[],"committee_members":[],"year":2026,"date_issued":"2026","date_published":"2026","updated_at":"2026-07-24T01:02:24Z","subjects":["Θετικές Επιστήμες","Science"],"languages":["English"],"rights":[],"rights_urls":[],"identifier_entries":[{"key":"dc:identifier","label":"Identifier","values":["uoadl:5376222"],"render_values":[{"text":"uoadl:5376222","href":null,"code":true}]}]},"links":{"outbound_url":"https://pergamos.lib.uoa.gr/uoa/dl/object/5376222","outbound_label":"Repository record","outbound_source":"dc:identifier"},"metadata_groups":[{"id":"people","label":"People","entries":[{"key":"dc:creator","label":"Author","values":["Τσιούνη Ειρήνη","Tsiouni Eirini"]}]},{"id":"academic_context","label":"Academic Context","entries":[{"key":"dc:date","label":"Dc Date","values":["2026"]},{"key":"dc:type","label":"Dc Type","values":["born_digital_postgraduate_thesis","Διπλωματική Εργασία","Postgraduate Thesis"]}]},{"id":"subjects_keywords","label":"Subjects and Keywords","entries":[{"key":"dc:subject","label":"Dc Subject","values":["Θετικές Επιστήμες","Science"]}]},{"id":"language_rights","label":"Language and Rights","entries":[{"key":"dc:language","label":"Dc Language","values":["English"]}]},{"id":"identifiers","label":"Identifiers","entries":[{"key":"dc:identifier","label":"Identifier","values":["uoadl:5376222","https://pergamos.lib.uoa.gr/uoa/dl/object/5376222"]}]},{"id":"additional","label":"Additional Metadata","entries":[{"key":"dc:description","label":"Description","values":["Η MALT1 (Mucosa-Associated Lymphoid Tissue Lymphoma Translocation Protein 1) αποτελεί βασικό ρυθμιστή της σηματοδότησης NF-κB, και η απορρύθμιση της δραστηριότητάς της εμπλέκεται σε ποικίλες αιματολογικές κακοήθειες και συμπαγείς όγκους, συμπεριλαμβανομένων του γλοιοβλαστώματος και του παγκρεατικού αδενοκαρκινώματος. Ο διττός ρόλος της στην επιβίωση των καρκινικών κυττάρων και στη διατήρηση των ανοσοκατασταλτικών ρυθμιστικών Τ κυττάρων (Τregs) στο μικροπεριβάλλον του όγκου καθιστά τη μερική αλλοστερική αναστολή την προτιμώμενη θεραπευτική στρατηγική - επαρκής για να παρεμποδίσει την ογκογόνο σηματοδότηση και τον επαναπρογραμματισμό των διηθούντων τον όγκο Tregs, ενώ παράλληλα διατηρεί επαρκή δραστηριότητα ώστε να αποφεύγεται συστηματική αυτοανοσία. Παρά την κλινική πρόοδο πολλαπλών μικρομοριακών αναστολέων, μακρομοριακές θεραπευτικές προσεγγίσεις και πρωτεϊνικοί προσδέτες έναντι της MALT1 δεν έχουν ακόμη αναφερθεί. Στην παρούσα μελέτη αναπτύξαμε μια in silico εκστρατεία σχεδιασμού de novo μικρών πρωτεϊνικών προσδετών στοχεύοντας δύο δομικά και λειτουργικά διακριτές αλλοστερικές θέσεις στην ανθρώπινη MALT1: τη Θέση 1 στην επιφάνεια της δομικής επικράτειας παρακασπάσης (PDB: 3V55, apo διαμόρφωση, hotspots V395, L440, I445, L448) και τη Θέση 2 στη διεπαφή των περιοχών παρακασπάσης/Ig3 (PDB: 6H4A, holo διαμόρφωση, hotspots V381, L383, N393, L401), με στόχο τον εντοπισμό ενός ποικιλόμορφου συνόλου υποψηφίων μορίων υψηλής υπολογιστικής αξιοπιστίας, κατάλληλων για πειραματική αξιολόγηση. Υλοποιήθηκε μια ολοκληρωμένη υπολογιστική μεθοδολογία που περιλάμβανε: de novo δημιουργία πρωτεϊνικών σκελετών με RFdiffusion (100.000 ανά θέση), σχεδιασμό αμινοξικής αλληλουχίας με SolubleMPNN, δομικό έλεγχο με AlphaFold3 όλων των συμπλόκων προσδέτη-MALT1, σειριακό φιλτράρισμα δύο σταδίων με κριτήρια δομικής αξιοπιστίας και δυνατότητας ανάπτυξης στο εργαστήριο, ανάλυση αμινοξικής ακολουθίας και δομικής ποικιλομορφίας με ιεραρχική ομαδοποίηση Ward και λεπτομερή χαρακτηρισμό των διεπαφών δέσμευσης δέκα επιλεγμένων υποψηφίων σε τρία επίπεδα εμπιστοσύνης χρησιμοποιώντας το AlphaBridge. Μέσω σταδιακού φιλτραρίσματος, από περίπου 200.000 αρχικούς προσδέτες (100.000 ανά θέση), διακρίναμε 505 (0.51%) πρωτεϊνικά μόρια για τη Θέση 1 και 961 (0.96%) για τη Θέση 2 που εμφανίζουν υψηλή προβλεπόμενη ποιότητα δέσμευσης, αυξημένη διαλυτότητα και ποικιλομορφία. Η ιεραρχική ομαδοποίηση Ward κατένειμε κάθε σύνολο σε πέντε δομικές ομάδες, παράγοντας δέκα αντιπροσωπευτικούς κορυφαίους προσδέτες – πέντε για κάθε θέση. Η παρούσα εργασία παρουσιάζει την πρώτη απόπειρα de novo σχεδιασμού μικρών πρωτεϊνικών συνδετών έναντι της παρακασπάσης MALT1, παρέχοντας δέκα δομικά χαρακτηρισμένους υποψηφίους υψηλής υπολογιστικής αξιοπιστίας σε δύο αλλοστερικές θέσεις, μέσω μιας αρθρωτής ολοκληρωμένης μεθοδολογίας τεχνητής νοημοσύνης που μπορεί δυνητικά να εφαρμοστεί σε ποικίλους πρωτεϊνικούς στόχους. Οι επιλεγμένοι υποψήφιοι θα αξιολογηθούν σε καρκινικές κυτταρικές σειρές υπερεκφράζουσες MALT1, προερχόμενες από ασθενείς με αδενοκαρκίνωμα παγκρέατος ή γλοιοβλάστωμα.","MALT1 (Mucosa-Associated Lymphoid Tissue Lymphoma Translocation Protein 1) is the only human paracaspase and a convergent downstream effector of the B cell receptor and GPCR/RTK signaling axis, whose constitutive activation drives NF-κB-dependent survival across both hematological malignancies and solid tumors, including glioblastoma and pancreatic adenocarcinoma. Its dual role in tumor cell survival and immunosuppressive regulatory T (Treg) cell maintenance in the tumor microenvironment makes partial allosteric inhibition the preferred therapeutic strategy - sufficient to impair oncogenic signaling and reprogram tumor-infiltrating Tregs, while preserving residual activity to avoid systemic autoimmunity. Despite the clinical progression of multiple small-molecule inhibitors, no protein-based binder against MALT1 has been reported, and the full topography of its allosteric regulatory surfaces remains unexplored by macromolecular modalities. In this study we developed and executed a rigorous in silico de novo mini-protein binder design campaign targeting two structurally distinct allosteric sites on human MALT1: Site 1 at the paracaspase domain surface (PDB: 3V55, apo; hotspots V395, L440, I445, L448) and Site 2 at the paracaspase/Ig3 domain interface (PDB: 6H4A, holo; hotspots V381, L383, N393, L401), with the goal of identifying a diverse, high-confidence set of candidates suitable for experimental validation. An end-to-end AI-driven computational pipeline was implemented comprising: de novo backbone generation with RFdiffusion (100,000 trajectories per site); sequence design with SolubleMPNN; AlphaFold3 co-folding structural validation of all binder-MALT1 complexes; two-phase sequential filtering encompassing structural and developability criteria; pairwise sequence and structural diversity analysis with Ward hierarchical clustering for diversity characterization; and AlphaBridge contact network analysis at three confidence thresholds for detailed characterization of the binding interfaces of the ten prioritized candidates. From approximately 200,000 raw design trajectories (100,000 per site), we identified 505 final candidates for Site 1 and 961 for Site 2 (passage rates 0.51% and 0.96% respectively), both exhibiting high predicted binding quality (median iPTM 0.860 and 0.820, median AlphaBridge score 0.860 and 0.880, respectively), 100% predicted solubility, and genuine diversity (mean pairwise sequence identity ~12%; mean pairwise TM-score 0.575 and 0.514). Ward clustering partitioned each pool into five structural clusters, yielding ten diverse, prioritized designs -five per interface. This work presents the first de novo mini-protein binder design campaign against the MALT1 paracaspase, delivering ten structurally characterized, high in silico confidence candidates across two allosteric sites through a modular, end-to-end AI pipeline, potentially applicable to other protein targets. These prioritized candidates will be validated in MALT1-overexpressing cancer cell lines to assess their translational potential."]},{"key":"dc:title","label":"Title","values":["De novo Design of Mini-Protein Binders Targeting Allosteric Sites of MALT1 Towards Cancer Therapeutics"]}]}],"canonical_facts":{"dc:creator":["Τσιούνη Ειρήνη","Tsiouni Eirini"],"dc:date":["2026"],"dc:description":["Η MALT1 (Mucosa-Associated Lymphoid Tissue Lymphoma Translocation Protein 1) αποτελεί βασικό ρυθμιστή της σηματοδότησης NF-κB, και η απορρύθμιση της δραστηριότητάς της εμπλέκεται σε ποικίλες αιματολογικές κακοήθειες και συμπαγείς όγκους, συμπεριλαμβανομένων του γλοιοβλαστώματος και του παγκρεατικού αδενοκαρκινώματος. Ο διττός ρόλος της στην επιβίωση των καρκινικών κυττάρων και στη διατήρηση των ανοσοκατασταλτικών ρυθμιστικών Τ κυττάρων (Τregs) στο μικροπεριβάλλον του όγκου καθιστά τη μερική αλλοστερική αναστολή την προτιμώμενη θεραπευτική στρατηγική - επαρκής για να παρεμποδίσει την ογκογόνο σηματοδότηση και τον επαναπρογραμματισμό των διηθούντων τον όγκο Tregs, ενώ παράλληλα διατηρεί επαρκή δραστηριότητα ώστε να αποφεύγεται συστηματική αυτοανοσία. Παρά την κλινική πρόοδο πολλαπλών μικρομοριακών αναστολέων, μακρομοριακές θεραπευτικές προσεγγίσεις και πρωτεϊνικοί προσδέτες έναντι της MALT1 δεν έχουν ακόμη αναφερθεί. Στην παρούσα μελέτη αναπτύξαμε μια in silico εκστρατεία σχεδιασμού de novo μικρών πρωτεϊνικών προσδετών στοχεύοντας δύο δομικά και λειτουργικά διακριτές αλλοστερικές θέσεις στην ανθρώπινη MALT1: τη Θέση 1 στην επιφάνεια της δομικής επικράτειας παρακασπάσης (PDB: 3V55, apo διαμόρφωση, hotspots V395, L440, I445, L448) και τη Θέση 2 στη διεπαφή των περιοχών παρακασπάσης/Ig3 (PDB: 6H4A, holo διαμόρφωση, hotspots V381, L383, N393, L401), με στόχο τον εντοπισμό ενός ποικιλόμορφου συνόλου υποψηφίων μορίων υψηλής υπολογιστικής αξιοπιστίας, κατάλληλων για πειραματική αξιολόγηση. Υλοποιήθηκε μια ολοκληρωμένη υπολογιστική μεθοδολογία που περιλάμβανε: de novo δημιουργία πρωτεϊνικών σκελετών με RFdiffusion (100.000 ανά θέση), σχεδιασμό αμινοξικής αλληλουχίας με SolubleMPNN, δομικό έλεγχο με AlphaFold3 όλων των συμπλόκων προσδέτη-MALT1, σειριακό φιλτράρισμα δύο σταδίων με κριτήρια δομικής αξιοπιστίας και δυνατότητας ανάπτυξης στο εργαστήριο, ανάλυση αμινοξικής ακολουθίας και δομικής ποικιλομορφίας με ιεραρχική ομαδοποίηση Ward και λεπτομερή χαρακτηρισμό των διεπαφών δέσμευσης δέκα επιλεγμένων υποψηφίων σε τρία επίπεδα εμπιστοσύνης χρησιμοποιώντας το AlphaBridge. Μέσω σταδιακού φιλτραρίσματος, από περίπου 200.000 αρχικούς προσδέτες (100.000 ανά θέση), διακρίναμε 505 (0.51%) πρωτεϊνικά μόρια για τη Θέση 1 και 961 (0.96%) για τη Θέση 2 που εμφανίζουν υψηλή προβλεπόμενη ποιότητα δέσμευσης, αυξημένη διαλυτότητα και ποικιλομορφία. Η ιεραρχική ομαδοποίηση Ward κατένειμε κάθε σύνολο σε πέντε δομικές ομάδες, παράγοντας δέκα αντιπροσωπευτικούς κορυφαίους προσδέτες – πέντε για κάθε θέση. Η παρούσα εργασία παρουσιάζει την πρώτη απόπειρα de novo σχεδιασμού μικρών πρωτεϊνικών συνδετών έναντι της παρακασπάσης MALT1, παρέχοντας δέκα δομικά χαρακτηρισμένους υποψηφίους υψηλής υπολογιστικής αξιοπιστίας σε δύο αλλοστερικές θέσεις, μέσω μιας αρθρωτής ολοκληρωμένης μεθοδολογίας τεχνητής νοημοσύνης που μπορεί δυνητικά να εφαρμοστεί σε ποικίλους πρωτεϊνικούς στόχους. Οι επιλεγμένοι υποψήφιοι θα αξιολογηθούν σε καρκινικές κυτταρικές σειρές υπερεκφράζουσες MALT1, προερχόμενες από ασθενείς με αδενοκαρκίνωμα παγκρέατος ή γλοιοβλάστωμα.","MALT1 (Mucosa-Associated Lymphoid Tissue Lymphoma Translocation Protein 1) is the only human paracaspase and a convergent downstream effector of the B cell receptor and GPCR/RTK signaling axis, whose constitutive activation drives NF-κB-dependent survival across both hematological malignancies and solid tumors, including glioblastoma and pancreatic adenocarcinoma. Its dual role in tumor cell survival and immunosuppressive regulatory T (Treg) cell maintenance in the tumor microenvironment makes partial allosteric inhibition the preferred therapeutic strategy - sufficient to impair oncogenic signaling and reprogram tumor-infiltrating Tregs, while preserving residual activity to avoid systemic autoimmunity. Despite the clinical progression of multiple small-molecule inhibitors, no protein-based binder against MALT1 has been reported, and the full topography of its allosteric regulatory surfaces remains unexplored by macromolecular modalities. In this study we developed and executed a rigorous in silico de novo mini-protein binder design campaign targeting two structurally distinct allosteric sites on human MALT1: Site 1 at the paracaspase domain surface (PDB: 3V55, apo; hotspots V395, L440, I445, L448) and Site 2 at the paracaspase/Ig3 domain interface (PDB: 6H4A, holo; hotspots V381, L383, N393, L401), with the goal of identifying a diverse, high-confidence set of candidates suitable for experimental validation. An end-to-end AI-driven computational pipeline was implemented comprising: de novo backbone generation with RFdiffusion (100,000 trajectories per site); sequence design with SolubleMPNN; AlphaFold3 co-folding structural validation of all binder-MALT1 complexes; two-phase sequential filtering encompassing structural and developability criteria; pairwise sequence and structural diversity analysis with Ward hierarchical clustering for diversity characterization; and AlphaBridge contact network analysis at three confidence thresholds for detailed characterization of the binding interfaces of the ten prioritized candidates. From approximately 200,000 raw design trajectories (100,000 per site), we identified 505 final candidates for Site 1 and 961 for Site 2 (passage rates 0.51% and 0.96% respectively), both exhibiting high predicted binding quality (median iPTM 0.860 and 0.820, median AlphaBridge score 0.860 and 0.880, respectively), 100% predicted solubility, and genuine diversity (mean pairwise sequence identity ~12%; mean pairwise TM-score 0.575 and 0.514). Ward clustering partitioned each pool into five structural clusters, yielding ten diverse, prioritized designs -five per interface. This work presents the first de novo mini-protein binder design campaign against the MALT1 paracaspase, delivering ten structurally characterized, high in silico confidence candidates across two allosteric sites through a modular, end-to-end AI pipeline, potentially applicable to other protein targets. These prioritized candidates will be validated in MALT1-overexpressing cancer cell lines to assess their translational potential."],"dc:identifier":["uoadl:5376222","https://pergamos.lib.uoa.gr/uoa/dl/object/5376222"],"dc:language":["English"],"dc:subject":["Θετικές Επιστήμες","Science"],"dc:title":["De novo Design of Mini-Protein Binders Targeting Allosteric Sites of MALT1 Towards Cancer Therapeutics"],"dc:type":["born_digital_postgraduate_thesis","Διπλωματική Εργασία","Postgraduate Thesis"]},"updated_at":"2026-07-24T01:02:24Z"}