{"id":{"repo_id":"ajou","oai_identifier":"oai:repository.ajou.ac.kr:201003/2244"},"canonical_url":"https://search.dev.ndltd.org/etd/ajou/oai:repository.ajou.ac.kr:201003/2244","repository":{"repo_id":"ajou","name":"Ajou University","base_url":"http://repository.ajou.ac.kr/oai/request"},"display":{"title":"Characterization of anti-DNA antibody with Tat peptide sequence in CDR","abstract":""Tat 펩티드가 삽입된 항-DNA 항체 구조의 생화학적 특성 항-DNA 항체인 3D8 단일 가닥 가변부위 (single chain variable fragment: scFv)는 핵산결합능 및 가수분해활성이 있으며, 3D8 VL 단독부위만으로도 핵산 결합능 및 가수분해능을 발휘한다. 또한 3D8 scFv는 세포막 침투능이 있어서, 세포막을 투과한 후, 세포질에 위치하게 되고, 결국은 세포사멸을 유도한다고 알려져 있다. 본 연구에서는 3D8 scFv의 핵산가수분해 활성은 그대로 유지하면서, 세포막 투과 후 핵으로 이동할 수 있는 3D8 scFv 변이체를, CDR 교체 방법으로, 제작하고자 하였다. 핵으로 이동하는 세포막 침투성 펩티드 (cell penetrating peptides)로서 가장 잘 알려진, 13개 아미노산으로 구성된 Tat 펩티드 (GRKKRRQRRRPPQ)를 3D8 scFv의 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3부위에 교체, 삽입된 scFv 변이체를 클로닝한 후, 단백질을 박테리아세포에서 발현, 정제하였다. 세 종류의 변이체 중에서 수용성 단백질로서의 발현률이 가장 높은 VH-CDR3 부위가 Tat으로 교체된3D8 scFv 변이체 (3D8s-HC3/Tat)의 DNA 결합력, DNA 가수분해능력, 세포내 침투능, 및 핵내로의 이동여부를 조사하였다. ELISA 및 SPR (surface plasmom resonance) 분석에서, 3D8s-HC3/Tat이 3D8 scFv과 유사한 정도의 DNA 결합력을 유지함을, in situ DNA가수분해활성 분석을 통하여 DNA 가수분해활성이 그대로 유지하고 있음을 확인하였다. HeLa 세포에서의 유세포 분석 결과는 3D8s-HC3/Tat 단백질이 3D8 scFv 와 유사한 정도로 세포내로 잘 유입되는 것을 보여주었다. Confocal microscopy 에서는 3D8 scFv이 관찰한 모든 세포의 세포질에서만 검출된 반면, 3D8s-HC3/Tat 는 관찰된 약 40%의 세포에서 세포질과 핵에서 모두 검출되었는데, 이는 Tat 펩티드의 특성에 의한 것이라 생각된다. 이러한 결과들은, 3D8 scFv의 원래 활성을 그대로 유지하면서도, 새로운 특성이 추가된 3D8 scFv 변이체의 생산이, 특정 CDR을 기능성 펩티드로 교체함으로써 가능하다는 것을 보여준다. 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Confocal microscopy 에서는 3D8 scFv이 관찰한 모든 세포의 세포질에서만 검출된 반면, 3D8s-HC3/Tat 는 관찰된 약 40%의 세포에서 세포질과 핵에서 모두 검출되었는데, 이는 Tat 펩티드의 특성에 의한 것이라 생각된다. 이러한 결과들은, 3D8 scFv의 원래 활성을 그대로 유지하면서도, 새로운 특성이 추가된 3D8 scFv 변이체의 생산이, 특정 CDR을 기능성 펩티드로 교체함으로써 가능하다는 것을 보여준다. 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In situ DNA hydrolysis assay 13 F. 단백질의 세포내의 확인을 위한 유세포 분석 (flow cytometry) 13 G. Confocal laser scanning microscopy 14 H. 3D8s-HC3/Tat 단백질의 plasmid DNA및 TAR oligonucleotide에 대한 결합력 비교 확인을 위한 ELISA 15 I. 3D8 scFv와 3Ds-HC3/Tat의 결합력을 알아보기 위한 표면 플라즈몬 공명 (SPR ; surface plasmon resonance ) 16 Ⅲ. 결과 20 A. 3D8 중쇄가변부위 (3D8VH)로의 Tat 삽입 20 B. Tat이 삽입된 3D8s-HC1/Tat, 3D8s-HC2/Tat, 및 3D8s-HC3/Tat 단백질 발현 25 C. 3D8s-HC3/Tat 단백질의 DNA 결합력 확인을 위한 ELISA 29 D. 3D8s-HC3/Tat 단백질의 DNA 가수분해 활성 31 1. Agarose gel electrophoresis 31 2. In situ DNA hydrolysis assay 31 E. 3D8s-HC3/Tat 단백질의 세포내 확인을 위한 유세포 분석 34 F. 3D8s-HC3/Tat 단백질의 위치 확인을 위한Confocal laser scanning microscopy 36 G. 3D8s-HC3/Tat 단백질의 DNA와 TAR oligonucleotide 결합력 비교 확인을 위한 ELISA 39 H. 3D8 scFv와 3Ds-HC3/Tat의 결합력을 알아보기 위한 표면 플라즈몬 공명 (SPR ; surface plasmon resonance ) 41 Ⅳ. 고찰 44 V. 결론 48 참고문헌 49 ABSTRACT 54 그림 차례 Fig. 1. Structure of immunoglobulin and antigen binding sites 3 Fig. 2. Structure of scFv (single chain variable fragment) 4 Fig. 3. The amino acid sequence of human immunodeficiency virus 1 (HIV-1) Tat protein 7 Fig. 4. Schematic diagram showing overlapping PCR and PCR Product for 3D8s-HC1/Tat, 3D8s-HC2/Tat and 3D8s-HC3/Tat 21 Fig. 5. Amino acid sequneces of TAT-grafted 3D8 scFvs into 3D8 VH-CDRs 23 Fig. 6. Bacterial expression of 3D8 scFv, 3D8s-HC1/Tat, 3D8s-HC2/Tat and 3D8s-HC3 /Tat protein 26 Fig. 7. Purification of 3D8 scFv and 3D8s-HC3/Tat 28 Fig. 8. ELISA for DNA binding activity of 3D8s-HC3/Tat 30 Fig. 9. DNA hydrolysis activity of 3D8 scFv and 3D8s-HC3/Tat 33 Fig. 10. Flow cytomery for intracellular uptake of 3D8 scFv, 3D8s-HC3/Tat and FITC-Tat 35 Fig. 11. Intracellular localization of 3D8 scFv, 3D8s-HC3/Tat, and FITC-Tat 37 Fig. 12. ELISA for binding activity to plasmid DNA and secondary TAR structure of 3D8s-HC3/Tat 40 Fig. 13. Binding kinetics of proteins measured by surface plasmon resonance 42 표 차례 Table 1. Cell-Penetrating Peptides 7 Table 2. PCR primers for 3D8s-HC1/Tat 17 Table 3. PCR primers for 3D8s-HC2/Tat 18 Table 4. PCR primers for 3D8s-HC2/Tat 19 Table 5. 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